• Forum - Structure, Formaldéhyde, Protéines, Anticorps

Différence de fixation des cellules

Avec le methanol, la fixation s'effectue par deshydradation (denaturation des proteines) alors qu'avec les aldehydes (formaldehyde, glutaraldehyde) on conserve la structure 3D de la proteine (fixation par pontage). Donc effectivement, si tu utilises un anticorps conformationnel, la detection de ton antigene sera impossible apres une fixation en methanol.  [...] Faut un peu se méfier de tout ce qui est immuno. Le résultat dépend grandement de la conformation de la protéine au moment où vous faites votre manip. En principe, les anticorps sont testés en western blot. Si il n'y a qu'une bande et de la taille attendue, c'est jugé comme bon et l'anticorps est déclaré spécifique.  [...]

Chromatin immunoprécipitation et protéomique

pour le unlik c'est censé etre pareil mais j'aurais justement voulu savoir si le seul chauffage détruisait spécifiquement les liaisons créées par le formaldéhyde et donc si je pouvais espérer récupérer les protéines.  [...] l'identification se ferait par spectro de masse donc pas de pb de structure et le formaldéhyde ne devrait pas trop bousiller les protéines vu que l'anticorps peut les reconnaitre. le probleme serait donc au niveau du decrosslink et peut etre de la quantité de prot.  [...]

[Biologie Moléculaire] Fixation des cellules

j'ai vraiment besoin quelqu'un qui peut me répondre a cette question,je veux visualiser en même temps les ultrastructures et les antigènes de la cellule, en effet j'ai utilisé le glutaraldéhyde et formaldéhyde pour une meilleure fixation mais il semble que y a pas de signal de mes protéines par microscopie photonique par contre une meilleure préservation de la structure de la cellule en M électronique,je veux vraiment trouver une solution pour voir mes protéines sans toucher la stabilité de structure de la cellule.  [...]

[Biochimie] Action du formol dans la conservation

le formol, ou formaldehyde, va fixer, au sens littéral du terme les cellules, ou plutot leurs constituants. Il sert à faire des ponts chimiques entre les protéines (aussi bien de structure que les enzymes), protéines/ADN, bloquant ainsi tout le fonctionnement des cellules.  [...] Lors d'expériences in vitro, sur des lysats cellules fixées au formaldehyde, pour obtenir un pontage ADN-protéines, apres purification des protéines, la fixation est réversée en chauffant les echantillons 5h (ou O/N) à 65°C.  [...]

[Biochimie] Séparation en gradient sucrose

L'idée pourrait être bonne si les lipides pouvaient être fixés par le formaldehyde, ce qui n'est pas le cas. Il y a tout de même les protéines autour de la membrane qui en étant fixées permettent le maintien de la structure membranaire, mais les lipides ne sont pas fixés pour autant.  [...] Autre chose. la microscopie à transmission avec marquage immunogold de ta protéine. Ainsi tu as accès à l'ultrastructure de la mitochondrie, normalement les rafts sont visibles en microscopie à transmission, mais pour les rafts mitochondriaux je ne sais pas.  [...]

[Biologie Moléculaire] Hybridation in situ et digoxygénine

Fixation au formaldéhyde (+ coupes si l'organisme n'est pas étudié in toto ) =. Perméabilisation (traitement à la protéinase K) =. Hybridation (ajout de la sonde ARN complémentaire) =. Lavage (élimination des sondes qui ne complémentent pas) =. Saturation des sites anticorps anti-digoxygénine =. Révélation (phosphatase alcaline etc.).  [...] On réalise la saturation avant d'ajouter l'anticorps. donc ici avant d'ajouter l'anticorps anti-dig (qui est le seul anticorps que tu ajoutes). dans une immuno avant l'anticorps primaire.  [...]

[Biochimie] Epigénome et immunoprécipitation

L'immunoprécipitation est une méthode utilisée pour étudier les séquences de DNA auquelles se lient les protéines. Pour ce faire on utilise du formaldéhyde qui gele les molécules, le liquide va fusionner de manière covalente les protéines au DNA. On va lyser les cellules et récupérer le DNA puis le fragmenter.  [...] Une fois fait, on enlève l'effet du formaldéhyde en chauffant et on détache les protéines, les séquences de DNA récupérée sont des séquences fixant des protéines. On peut soit les séquencer à ultra haut débit soit les hybrider sur des puces pour voir à quoi elles correspondent.  [...]

[Divers] Intérêts du NaDOC, SS DNA, chelex, Tris Cl dans plusieurs expériences

Je réalise des ChIP (chromatin immunoprecipitation), et après extraction de l'ADN sur lequel les protéines ont été crosslinkées au formaldehyde, l'ADN est dans un tampon dit d'immunoprécipitation. celui-ci contient du NaDOC... à quoi cela sert-il.  [...] Après immunoprécipitation, le reverse crosslink est effectué avec du chelex. comment cela fonctionne est-ce que les anticorps restent accrochés aux billes ou est-ce qu'ils sont en solution avec les protéines (par la suite dégradées avec de la protéinase K).  [...]

[Divers] Protocole de conditionnement en Histologie

La fixation est la première étape. il s'agit de fixer le tissu en créant des laisons entre les constituants du tissu pour conserver sa structure et le conserver. Pour cela on peut le tremper dans diverses substances. le PFA, le formaldehyde, le formol, le TCA, etc.  [...] En fait pour pouvoir étudier la structure d'un tissu il faut le couper en tranches. Pour cela on est obligé de l'inclure dans une substance qui permet de préserver l'organisation du tissu et d'obtenir des coupes suffisamment fines pour l'observation. Exemple.  [...]

[Biologie Moléculaire] Lyse cellulaire

J'ai trouvé une solution en fait. créer un mutant de notre protéine avec uniquement le domaine qui m'intéresse plus quelques acides aminés pour le lier à un anticorps sur une colonne. Reste à faire passer les lipides dans la colonne et récupérer le complexe. Je pense que ça peut le faire.  [...] non, un crosslinker = un produit qui fait des liaisons covalentes entre tous les trucs qui passent à sa portée. C'est utilisé pour fixer des liaisons labiles le temps de purifier une interaction. Par exemple on l'utilise en ChIP pour fixer les protéines sur l'ADN, avant de lyser les cellules et de récupérer l'ADN lié aux protéines d'intérêt (formaldehyde par exemple).  [...]