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[Biologie Cellulaire] Signalisation cellulaire

actuellement en stage, je travaille sur de nouvelles cibles protéiques intracellulaires qui phosphorylées se fixent sur les protéines 14-3-3 dans la voie de signalisation de l'insuline. Je stimule des cellules HEK 293 avec IGF1 et PMA (phorbol ester 12-myristate 13-acetate), et j'inhibe avec BID (BI-D1870) et PI103 ( PI3 K inhibitor).  [...] J'ai beaucoup cherché sur Internet des schémas dans le but de comprendre au mieux les mécanismes émanant de la stimulation insulinique mais j'ai toujours beaucoup de mal. C'est pourquoi, j'aimerais savoir si quelqu'un pourrait m'expliquer de manière concise même si je me doute que la signalisation cellulaire est très complexe, quels sont les principaux mécanismes cellulaires après stimulation par IGF1 et si possible incluant les protéines comme PMA, PKC, PKB, Erk1/2, p90 RSK, PI 3 kinase et BID.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème marquage Actin par la Phalloidine

Voila, je suis actuellement en stage et j'étudie l'interaction de différentes protéines dans les cellules de Sertoli.  [...] Ensuite je réalise un marquage de l'actin en utilisant de la phalloidin couplé à un fluorophore. Je ne parviens pas à obtenir un marquage correct de l'actin. Mon maitre de stage pense que je réalise trop de rinçage après la phalloidin (alors que c'est dans son protocole).  [...]

[Biologie Cellulaire] Ces cellules sont-elles en apoptose ?

Au cours d'un stage j'ai eu l'occasion de faire de la culture cellulaire et après traitement de cellules Calu-6 (issues d'un carcinome anaplasique de poumon) j'ai obtenu la photo ci-dessous. Le truc c'est que ces cellules n'expriment peu ou pas p53 et on m'a dit qu'il n'était pas possible qu'elles puissent entrer en apoptose sans cette protéine.  [...] Pour ta photo on sait que les cellules en apoptose prennent une forme sphérique et se détachent des autres, mais je ne préfère rien te dire, je n'ai jamais vu les tiennes.  [...]

[Biologie Cellulaire] CSM et pcdan 3

Je commence un nouveau stage depuis peu et le labo travaille sur des cellules souches mésenchymateuses. Une manip consiste à les transfecter stablement avec le plasmide pcdna3 ou pcdna3.1 afin d'exprimer stablement une protéine (donc sous contrôle du promoteur fort CMV).  [...] Le soucis est qu'ils ont pu remarqué depuis quelque temps l'expression du gène tend à diminuer au bout d'un moment, et que donc l'expression constitutive ne l'est plus tant que ça.   [...]

[Biologie Moléculaire] Immunoprécipitation

J'ai une question concernant l'électrophorèse et l'immunoprécipitation. Pendant mon stage j'ai effectué d'abord une lyse cellulaire ensuite une séparation des protéines par électrophorèse et puis un western blot pour identifier la protéine recherchée. Une autre fois, pour la même protéine, j'ai fait l'immunoprécipitation puis le reste jusqu'au western blot.  [...] Alors ma question c'est, pourquoi on fait l'immunoprécipitation qui est une méthode beaucoup plus longue et où on peut avoir des interférences avec des chaînes légères (peut être parce que seule protéines est présente sur la membrane) et peut être aussi parce que avec une électrophorèse sur les protéines totales il peut y avoir des interactions aspécifiques protéine-anticorps.  [...]

[Biochimie] Se débarasser de l'activité enzymatique résiduelle dans une cellule

Dans mon stage où je dois visualiser les profils d'acyles-CoA en LC/MS-MS, je dois traiter des culots de cellules de malade MCAD ( maladie où la protéine MCAD subit des mutations l'empêchant de dégrader des acides gras à chaine moyennes lors de la réaction de beta oxydation, et entrainant leur accumulation).  [...] j'ai pensé à éliminer cette activité résiduelle en confrontant les cellules à un choque de température élevée ou utiliser de l'acétonitrile, il y a aussi une troisième possibilité dont je suis pas encore sure c'est de faire un choque de température bas dans l'azote par exemple.  [...]

Co-immunoprécipitation: à quoi sert le flowthrough?

Bonjour, j'ai récemment effectué un stage où j'ai fais une co-immunoprécipitation avec des billes magnétiques, sur des cellules lysées. Avant d'éluer les complexes billes -anticorps-antigènes, on a placé les tubes sur le support aimanté pour récupérer le surnageant que mon maître de stage a appelé flow through.  [...] Le flow through est censé ne contenir que les autres protéines cellulaires dont je n'ai pas besoin Si la co-pi a fonctionné je ne devrais rien avoir dessus au WB (ou montrerait les restes de protéines d'intérêt n'ayant pas lié) Cela sert à savoir si la liaison entre l'anticorps et la protéine est bonne ou mauvaise.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.. Je sais plus quoi faire.  [...] Je préfère faire séparemment même si mes protéines ont + de 10kD de differénce (enfin c'est mon maître de stage qui veut pas que je mélange mais il me donne aucune autre solution).  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème test MTT et différenciation

Je suis acutellement en stage dans un laboratoire de toxicologie cellulaire, dans lequel je test des molécules sur des cellules hépatiques. lignée HepG2, et sur des cellules neuronales non différenciées. lignée SK-N-BE(2).  [...] Mon protocole est le suivant. dans une plaque 96 puits incubé 24h pour les cellules HepG2 et 48h pour les cellules SK-N-BE(2) à l'avance (à une concentration de 60 000 cellules/puits), je retire le milieu complet (avec SVF) de mes puits puis je dépose le traitement (molécule diluée dans du milieu incomplet.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Normalement oui tu mettre des plasmides dans des cellules eucaryotes puisque quand j'étais en stage on avait transplanté des plasmide à l'intérieur de cellules cancéreuse. Il s'uffit de faire une électroporation ou autre manipulation du genre pour qu'il soit intégré.  [...] imaginons que je veuille étudier une protéine tagguée ou un promoteur a l'aide d'un gène reporteur, dois-je obligatoirement utiliser un plasmide pr transfecter ma cellule par lipofection ou biolistique.  [...]