• Forum - Sonde, Amorces, Concentration

[Biologie Moléculaire] qPCR

Classiquement, les concentrations amorces peuvent varier entre 300 et 900nM final. Les concentrations de sondes entre 100 et 400nM final. Les ratios les plus communs sont donc entre 1/5 et 1/2.  [...] De ton coté, je pense qu'il vaut mieux partir avec tes concentrations d'amorces optimisées en Sybr et caler la sonde pour le TaqMan à une concentration moyenne de 200nM final. Ensuite, faire varier la concentration de sondes entre 100 et 400 et regarder si les résultats sont corrects.  [...]

[Biologie Moléculaire] primer dimer

La formation de dimères est due à des conditions de PCR trop permissives, après évidemment un design d'amorces non optimum. Les paramètres que l'on peut modifier sur un qPCR pour diminuer les dimères sont la température d'hybridation (la diminuer), puis la concentration en MgCl2 (la diminuer), et évaluer le ratio sonde/amorces en concentration.  [...] Pour dessiner des amorces qui ne font pas (PCR quanti) ou pas trop (PCR point final) d'appariements sur elles-mêmes ou sur l'autre amorce de la PCR, il faut les aligner en antiparallèles avec ton programme de manipulationqs de séquences (DNA Strider, NTI Vector, etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Question sur le design de sondes Taqman pour la PCR en temps réel

Lors du design de sondes Taqman avec un quencher BHQ, on part du principe que le Tm de la sonde doit être de 7-10°C de plus que celui des amorces, afin de s'assurer la spécificité de l'hybridation de la sonde.  [...] Quel est le risque d'utiliser une sonde Taqman BHQ dont le Tm est le même que celui des amorces Peut-il y avoir de l'amplification non spécifique de la cible pour laquelle le modèle a été designé La limite de détection du modèle peut-elle être modifiée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Design de sonde Taqman à partir d'une sonde FISH

Je voudrais savoir s'il est possible d'utiliser une sonde FISH (ciblant le 16S de bacteroides) comme sonde Taqman pour la quantification de la bactérie, si oui, comment on fait s'il vous plait Mon superviseur me demande d'utiliser la même séquence de la FISH (déjà publiée) pour la RT-PCR, mais aussi de designer des amorces de part et d'autre de cette séquence pour 1 PCR classique.  [...] Ma suggestion était de prendre la séquence de la sonde FISH, faire des blast et ressortir les séquences des régions 16S des bacteroides ssp., faire des alignements de séquences et ressortir une séquence consensus. A partir de cette séquence consensus, je pourrai designer la sonde Taqman et les amorces, mais il ne veut pas cette suggestion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plan de plaque, validation de méthode...

Oui exactement j'ai bien évidemment prévu de mettre en place des gammes de concentrations différentes comme référencée dans la littérature, triplicates aussi. Il y aurait-il d'autres exemples.  [...] Ensuite il sera assez simple de calculer les efficacités d'amplification, de trouver les bonnes concentrations pour les amorces et la sonde, de déterminer la répétabilité et la reproductibilité.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème d'amplification positive avec de l'eau en q-PCR!

Est ce que ca viendrait d'une dimérisation d'une des amorces avec la sonde Combien faut il de nucléotides en commun pour qu'il y ai cette dimérisation.  [...] La sonde est placée entre mes deux amorces, mais non avec des sondes taqman il n'est pas possible de faire les melt cuve et voir les Tm. Ce qui me serait bien utile pour différencier une amplification de mon gene d'intert ou une dimérisaton des amorces.  [...]

Pcr

Quelqu'un pourrait-il m'expliquer la technique de la PCR s'il vous plaît Il y a de fortes chances que cela tombe au concours mais je ne vois pas le principe... Y a-t-il des sondes qui interviennent dans cette technique.. Je suis un peu perdue.  [...] on ne parle pas de sonde mais d'amorces pour la PCR (ou primer en Anglais).  [...]

[Biologie Cellulaire] recherche recette de Loading Buffer et Protocols de RT-PCR semi quantitative

Les possibilités de fluorescence sont le SYBR GREEN ou les sondes FAM-TAMRA. Le sybr green est un intercalent de l'ADN. Les sondes FAM-TAMRA sont des sondes avec un fluorescent et un agent quienscent (de part et d'autres de la sonde). lors de ta PCR les amorces vont amplifier ton fragment et la sonde presente entre des deux amorces va etre degradée ainsi le fluorescent est libéré et quantifié.  [...] deuxieme chose pour le SYBR GREEN. tes amorces doivent bien choisies car tu vas amplifier aussi des zones non interessantes et comme c un intercalant tu quantifieras tout. Mais tu as un moyen de savoir si c'est du spécifique ou non rassures toi.  [...]

RT PCR quantitative

En plus des amorces reconnaissant l'ADNc voulu il y a dans le kit PCR une sonde possédant à ses extrêmités une molécules fluorescente et un quencher qui inhibe la fluorescence. Lorsque la Taq polymerase agit, elle va détruire le quencher et la sonde va pouvoir émettre une lumière.  [...] Donc plus tu auras d'amplification et plus ton signal fluorescent sera grand. C'est une mesure de cette fluorescence qui sera établit.   [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel

euh, je pense que tu fais une petite erreur Annaick sur la stringence de la PCR par l'augmentation du MgCl2. Si tu augmentes sa concentration, la PCR deviendra plus permissive aux réactions non spécifiques. Si tu veux augmenter la stringence de ta PCR pour diminuer les Dimères, il faut tester la diminution de la concentration en MgCl2, augementer la température d'hybridation de ta PCR, ajouter une sonde TaqMan et lui donner la concentration la plus faible possible pour ton système.  [...] En effet, les dimères peuvent être embetant pour une réaction, mais encore faut il savoir quelle est la quantité de dimère produit, sa taille approximative (estimation grossière par courbe de fusion) et voir si ta cible est en faible quantité ou pas. Si tout ceci n'est pas dommageable pour ta PCR, et si derrière tu colles une sonde TaqMan, il n'est pas utile forcément de trouver le couple d'amorces idéal... et tu pourrais garder celui ci.  [...]