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[Biochimie] Problème avec mon western

La déshybridation, je n'ai jamais trop aimé, rien ne vaut la première hybridation. Si la déshybridation ne se fait pas très bien, si l'anticorps précédent est très affin pour son antigène, il reste un fort bruit de fond et la fixation du second anticorps primaire n'est pas optimale.  [...] Ou alors essaye la technique proposée par Gorben, mettre tes deux anticorps primaires dans la même solution de TBS-T lait. Mais toutefois, je te conseille de faire attention les premières fois, il faut que tu t'assures que cela ne modifie pas, pour x raisons, le profil de ton western.  [...]

[Biochimie] Western blot incubation Ac I sous sachet scellé

La solution de TBS-T lait avec anticorps primaire bouge rarement de façon visible dans la poche d'incubation. Pourtant à une échelle inférieure, invisible, il y a bien un mouvement suffisant pour avoir un marquage homogène. Le fait que vous ayez un signal fort provient soit d'une trop forte concentration en anticorps primaire, soit une concentration trop forte en anticorps secondaire, soit d'un temps d'exposition trop long.  [...] Quelques toutes petites bulles pourquoi pas, mais il faut absolument éviter les grosses bulles qui viendraient se plaquer sur la membrane, ou rendre le contact avec le lait + Anticorps inhomogène sur la membrane.  [...]

[Divers] Contenu "Matériels et méthodes" - rapport stage M1

Après transfert, la membrane est bloquée dans une solution de lait 5% TBS-Tween 0,2% pendant 1 heure à température ambiante sous agitation. Elle est ensuite incubée avec les anticorps primaires anti-BRCA1 monoclonal (D9) dilué au 1/500 (Sigma®), anti-HSP60 monoclonal (CK) au 1/1000 (Sigma®) pendant une nuit à 4°C sur une plaque rotative.  [...] Après 3 lavages dans du TBS-Tween 0,2%, la membrane est incubée pendant 1 heure en présence de l'anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à l'HRP (Horse Radish Peroxidase, Cell Signaling) dilué au 1/5000 dans du lait 5% TBS-Tween 0,2% sous agitation.  [...]

Saturation BSA pour purif de protéine His-tagged

Durant mon mémoire, j'ai du faire beaucoup de mise au point de mes WB, un des anticorps primaire donnait des bruits de fond terrible, Je suis arrivée à des résultats incroyable en enlevant la BSA d'un part et en la remplacant dans les différentes solution le lait gloria par le lait amersham.  [...] Merci Fatcha mais là je ne pense pas que ce soit un problème d'anticorps. L'anticorps que j'utilise est super bon et on a tous cette bande (je travaille avec 2 autres personnes sur la même thématique). Pour les western par contre j'utilise du lait Marvel. C'est vachement bien mais on ne le trouve qu'en Angleterre donc pas super pratique.  [...]

La digestion des lipides

10mL de lait, 1mL de solution de tournesol (indicateur de pH), 2 gouttes de soude et 3mL de solution d'extraits pancréatiques préalablement boullis.  [...] On a la présence de l'enzyme ( solution d'extraits pancreatiques) et de son substrat qui est le lipide constituant le lait. On est dans un milieu neutre car la soude est basique et la solution d'extraits pancreatiques est acide d'où un équilibre (je ne suis pas sûr de ça et je voudrais des explications).  [...]

[Physiologie] le prion

Tous les bébés humains reçoivent une certaine protection avant la naissance. Durant la gestation, la mère transmet des anticorps à son fStus à travers le placenta. Ces protéines circulent dans le sang du nourrisson durant quelques semaines à quelques mois après la naissance, neutralisant les microbes ou les marquant pour la destruction par des phagocytes, des cellules immunitaires qui consomment et détruisent les bactéries, les virus et les débris cellulaires.  [...] Cependant, les bébés allaités gagnent une protection supplémentaire provenant des anticorps, autres protéines et cellules immunitaires du lait humain.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins - Page 2

Pour pAkt, il faut essayer différentes conditions de blocage, notamment BSA et lait, et aussi changer le milieu d'incubation de l'anticorps (lait ou BSA également).  [...] Merci encore pour tes reponses, mais comment immunoprécipiter mes échantillons As tu un protocol CONCERNANT LES solutions acides isotoniques, solution de ß-mercaptoethanol, As-tu des concentrations a me donner Comment les preparer et laquelle marche le mieux.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

A la révélation, je n'ai aucune bande ou au contraire quelque fois j'ai des bandes intéressantes mais qui ne correspondent pas à la taille de la protéine (250kDa). (L'anticorps utilisé est celui qui est le plus abondant dans les publications).  [...] La protéine apparait autour de 100kDa au lieu de 370kDa. Je voulais savoir si quelqu'un avait déjà ce problème avec cet anticorps.  [...]

[Biologie Cellulaire] Immunocytolocalisation - Anticorps primaire 3-4h ?

Je dois faire des immunolocalisations sur cultures cellulaires. Mon anticorps primaires fonctionnent vraiment très bien (anti-FLAG M2).  [...] En tout cas, je vous confirme bien que cela fonctionne. Comme je n'avais pas encore lu les dernières réponses, j'ai fait 30 min de fixation, blocage au lait 10% pdt 1h, 3h d'anticorps primaire et 1h d'anticorps secondaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Au secours : Western en danger

Voila, j'ai un gros soucis mon labo ferme le WE et j'ai mis la solution de saturation qui s'avère etre du lait a 5% dans du TBS-T... Je ne peux pas le laisser tout le WE... Est-ce que si je seche la membrane je vais abimer les bandes Est ce que je dois laver, laisser dans du tampon tout le WE.  [...] Et vous pouvez de toute façon laisser le lait tout le WE à 4° si vous avez fait la solution ce soir ou dans l'après midi.  [...]