• Forum - Solution, Bactéries, Plasmide

Extraction du plasmide

la solution de lyse (comme son nom l'indique) va détruire les bactéries afin que les plasmides se retrouvent dans ta solution et non pas inaccessibles, protégées dans les bactéries.  [...] la solution de neutralisation neutralise l'effet de la solution de lyse une fois que tes bactéries sont lysées car a long terme ça peut être néfaste pour ton plasmide, et il me semble (mais je ne suis plus sur) que dans ce kit la neutralisation entraîne aussi la coagulation des débris bactériens qui apparaissent sous forme de nuage blanc dans ton tube afin de pouvoir mieux les éliminer par centrifugation.  [...]

Precipitation adn plasmidique

Bonjour, après une extraction d'adn plasmidique avec un kit qiagen, je me retrouve avec de faibles concentrations de plasmide. Je souhaterais donc le concentrer un peu afin de pouvoir par la suite le sequencer.  [...] Autre solution tu rajoute a ta culture sur la nuit un peu de chloramphenicol pendant quelques heures. Ca bloque la multiplication des bacteries mais n'affecte pas pas la replication de l'ADN. donc tu augmente la quantité de plasmide dans tes bacteries.  [...]

Extraction d'acides nucléiques

J'aurais voulu connaître succinctement les principes généraux (et pas les protocoles..) des méthodes d'extraction de l'ADN plasmidique, ADN totaux, ADN chromosomique, ARN. Parmis les ARN peut on séparer les ARNr, ARNt et ARNm.  [...] Sinon a partir de la solution (extraction à partir de cellule de mammifere, levures etc..) de départ tu transformes des bacteries pour isoler le plasmide.  [...]

Des OGM maison ?

Avec l'évolution des différentes méthodes d'extraction de l'ADN et de manipulation génétique, je me demandais, au delà de toute considération éthique, s'il était aujourd'hui envisageable de modifier génétiquement des organismes simples (du genre e. coli) en leur injectant des gènes déjà connus et séquencés, dont la fonction est bien identifiée, le tout avec un faible budget (quelques centaines d'euros tout au plus) et du matériel de laboratoire de base.   [...] la deuxieme méthode necessitera un peu plus de matériel et connaissance, mais au final, c'est plus ou moins juste un choc electrique sur des bactéries en solution avec le plasmide à insérer.  [...]

[Microbiologie] Culture bactérienne troublante

Avec le plasmide controle, la culture présentait un aspect habituel avec une solution LB trouble assez homogène. En revanche la culture avec le plasmide d'intérêt présentait de gros agglutinement de bactéries au fond de la bouteille en plus du LB trouble.  [...] ce peut il alors qu'en changeant de plasmide le résultat change et par conséquent si l'on effectue la transfection sur des bactéries des plasmides différents ayant tous les meme gene d'interret ( dans des expériences séparées sur la meme souche de bactérie) des résultats différents.  [...]

[Microbiologie] bacterie resistantes

- Au cours des divisions cellulaires, le plasmide peut ne pas être transmis à certaines bactéries filles, il y aura donc apparition de bactéries non résistantes.  [...] - Lorsqu'on insère un plasmide dans des bactéries, certaines bactéries du lot n'insèrent pas le plasmide et restent donc non résistantes.  [...]

[Microbiologie] Correction Dilution en cascade (solution plasmidique)

On prend 10µL de cette solution soit 10*5 = 50ng de plasmide que l'on ajoute à 10µL d'eau, la nouvelle solution a une concentration de 2.5ng/µL ect...(Est-ce que j'ai bien expliqué le principe En fait je viens de me rendre compte en écrivant que je confondais les 50ng/µL avec les 50ng dans 20µL ce qui n'est pas du tout la même chose.  [...] En fait je me suis trompé au départ ce n'est pas une solution de 200ng/µL mais une solution contenant 200ng de plasmide. Pourquoi d'ailleurs partons nous de cette solution et pas directement de la solution contenant 100ng de plasmide (ce qui reviendrait à mélanger 2µL de la solution de départ avec 18µL d'eau).  [...]

[Biotechnologie] Méthode de purification de l'insuline recombinante

Je vous explique vite fait le contexte, le gène de l'insuline humaine est placé dans un plasmide, ce plasmide dans la bactérie et après sélection de la bonne colonie de bactérie on place la solution bactérienne dans un fermentateur pour obtenir beaucoup d'insuline, etc.  [...] Je sais qu'il y a beaucoup de méthodes de purification mais je ne sais pas laquelle est la plus adapté pour purifier l'insuline une fois que l'on a obtenu l'extrait protéique (insuline + toutes les autres protéines synthétisées par la bactérie).  [...]

Plasmide et gène LacZ

La première étape de l'utilisation des plasmides est la détermination des bactéries transformant (qui ont intégré un plasmide non recombinant) et des bactéries transformant recombinant (qui ont intégré des plasmides recombinant, i.e. contenant le gène luc), par rapport aux bactéries non transformant.  [...] Je pense qu'il y a une erreur parce que les bactéries non transformantes ont déjà été éliminées par l'action de l'antibiotique (Amp). Le système LacZ permet de différencier les bactéries (ou colonies) qui ont un plasmide avec l'insert (bactéries transformantes recombinantes) et celle qui ont le plasmide sans l'insert (bactéries transformantes non recombinantes) de part la couleur des colonies observées sur boîte de Pétri (si le milieu est préparé avec de l'IPTG et du XGal).  [...]

[Biologie Moléculaire] pb de mutagenèse dirigée

mon problème est que je n'obtient pas de colonies avec mon plasmide recombiné, les témoins de mutagenèse et de transformation sont OK, j'ai bien des colonies bleues et blanches. mais les bactéries traitées avec mon plasmide ne poussent pas sur le milieu de culture LB+ampicilline quelque soit la quantité d'ADN ou de solution bactérienne étallée.  [...] Mon conseil est de modifier tes cycles de PCR pour améliorer ton amplification (je fais classiquement au moins 25 cycles). et il m'est arrivé de remplacer la pfu par la phusion de chez (Finzyme) qui amplifie 1kb en 15s. ce qui est appréciable pour les gros plasmides.  [...]