• Forum - Sites, Restrictions, Amorces

[Biologie Moléculaire] aide sur le séquençage de l'ADN

Pas nécessairement si vous avez déjà un vecteur ayant des sites uniques de restrictions compatibles avec ceux éventuellement présents au bout de vos amorces.  [...] En envoyant les amorces avec lesquelles vous avez fait la PCR (si ce ne sont pas des amorces universelles) au prestataire qui fait le séquençage, vous pourriez vous épargnez le clonage.  [...]

[Biotechnologie] Le clonage

Je suis devant un exercice où je dois donner les différentes étapes me permettant de construire un plasmide recombiné. Celui-ci ayant deux site de restriction CpoI. Je dois y inserer un gène, mais dans la séquence de part et d'autre du gène je n'ai pas de site de restriction.  [...] Je disais qu'il fallait juste amplifier le gène par PCR en ajoutant des sites de restrictions CpoI dans les amorces, digérer le produit de PCR et assembler le tout.  [...]

PCR, template et riz anti-alzheimer

- pour faire cela, on prend des amorces sens et anti-sens (type AB-5'-HindIII et AB-3'-XhoI, donc entourant le gène d'intéret) contenant des sites de restrictions et on fait une PCR.  [...] 3) les sites de restriction permettent en effet que les extrémités de tes morceaux soient cohésives. Donc on peut extraire un fragment entre certains sites, et si on choisit bien son plasmide receveur, l'insérer de facon orientée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ajout de sites de restrictions

Ce qu'il faut faire c'est simplement prendre votre ORF et l'amplifier par PCR en ajoutant aux amorces les sites de restrictions+ 6 nucléotides aléatoires.  [...] En faisant comme cela, vous allez récupérer votre ORF borné par les sites de restriction. Vous n'aurez plus qu'à digérer et cloner directement dans votre plasmide d'intérêt.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de culture de bactéries

Voila je suis actuellement un stage dans un laboratoire de biologie du dévellopement. Je cherche a séquencer Par PCR dégénerée un fragment de gène. Nous utilisons nos amorce 5' et nos amorces 3' etc... vérification sur gel d'Agarose 1% avec BET tout va bien on a deux réponse positive dont une migration assez importante et intressante.  [...] Essaie un autre vecteur pour le clonage peut-être, avec le vecteur TOPO plutôt que pGEmt-easy. Ou bien en amplifiant avec des amorces ayant des sites de restrictions puis clonage dans un vecteur adapté à ce que tu veux faire de tes inserts.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage orienté, design d'amorces

3) En introduisant les sites de restrictions dans mes amorces, cela peut engendrer un décalage du cadre de lecture... Comment le vérifier (j'ai essayé des logiciels comme Geneious & Co... mais ne maitrisant pas ces logiciels j'ai perdu plus de temps qu'autre chose ).  [...] Pour qu'une bonne digestion se fasse sur un produit pcr, il faut généralement que ton site de restriction soit entouré de nucléotides de part et d'autre. Donc il ne faut pas juste rajouter ton site de restriction à ton primer, mais aussi des nucléotides supplémentaires.  [...]

[Génétique] Construire un vecteur de transgenèse dérivé des transposons

Pour ce faire nous allons réaliser une PCR du gène Tet avec deux amorces contenant des sites de reconnaissances pour les enzymes de restriction XbaI et HindIII. Visiblement les amplicons obtenus possèdent à chaques extrémités le site de reconnaissance pour ces enzymes de restrictions et une Adénosine (d'ailleurs là j'ai pas compris d'où elle vient).  [...] 3-On introduit les enzymes de restrictions XbaI et HindIII. on va avoir le fragment Tet qu'on va ensuite insérer dans pBCKs+.  [...]

[bio mol] pUC et LacZ

S'il n'y avait qu'un seul site de clonage, tu aurais une grosse contrainte sur ton ADN de départ et donc presque jamais la possibilité de le découper pour en isoler ton fragment d'intérêt (ou alors, tu aurais à l'amplifier avec de amorces portant le site de restrictions, ce qui est plus lent et peut génerer des erreurs).  [...] par conséquent ça augmente les chances de trouver des sites de restrictions correspondant aux sites qui bordent notre insert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage - Page 2

donc l'objectif etait de faire une amorce sens a gauche en inserant un site de restriction une amorce qui est vers le MCS mais là elle permet d'apporter 2 sites de restrictions et de l'autre coté faire une amorce sens a droite en inserant un site unique (les deux inserts ont donc a leurs extremités un site unie et au milieu au refait un MCS) et de meme son amorce complémentaire est vers le MCS et permet d'inserer 2 nouveaux sites de restrictions.  [...] je suis bien d'accord, mais ces sites vont etre au niveau des morceaux de genes aux extremités que je ne veux pas donc certes apres restrictions ils seront amputés et donc pas fonctionnel mais il y aura toujours des morceaux donc c'est pas très propre, les deux sites uniques que j'ai mis juste pour cadrer la sequences que je veux ont ce role, d'eviter d'avoir les parties aux exterieurs.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment design des amorces PCR..

Bah oui justement le site de restriction je dois le mettre au début de mes amorces pour pouvoir l'insérer ensuite dans le plasmide de la bactérie digérée par BamH1 et Sma1. Mais je sais pas s'il faut compter les nucléotides (qui font donc partie de l'amorce.  [...] Et en fait ouais je m'étais emmêlé les pinceaux avec les sites de restriction, sur ma fiche ils étaient ecrits à l'envers, donc j'ai fait n'importe quoi en faisant les premières amorces.  [...]