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Comment orienter un fragment d'adn dans un vecteur

Donc pour cela je suppose qu'on peut utiliser des primers avec une partie 5' non complémentaire qui permet de générer un site de restriction différent selon le côté du fragment ce qui permet d'introduire le fragment dans le bon sens en utilisant les 2 sites différents.  [...] L'utilisation de sites de restriction est le seul moyen pour faire cela. Une autre solution est de ne pas orienter le fragment, et une fois le clonage fait tester les plasmides pour trouver ceux qui auront un insert dans le bon sens. Apres tout tu as 50% de chance que ton insert soit dans la bonne orientation.  [...]

PCR et plasmide-protocole article scientifique en anglais (dsl) non compris help!!!

Full length PCR product was purified by electrophoresis in a 1% agarose gel using the QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen) and was inserted into a pDONR/Zeo entry vector using a PCR Cloning System with the Gateway Technology kit (Invitrogen). Starting with this entry clone, the hASP DNA construct was cloned into a pDEST15 expression vector to obtain the DNA for the GST fusion protein.   [...] En survolant rapidement, il m'a semblé comprendre que c'est un premier plasmide qui te premet ensuite d'inserer plus facilement ton fragment d'interet dans tout types de vecteurs d'expression, sans avoir à te preoccuper de choisir tes sites de restriction, et de reflechir au sens.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage - Page 2

donc l'objectif etait de faire une amorce sens a gauche en inserant un site de restriction une amorce qui est vers le MCS mais là elle permet d'apporter 2 sites de restrictions et de l'autre coté faire une amorce sens a droite en inserant un site unique (les deux inserts ont donc a leurs extremités un site unie et au milieu au refait un MCS) et de meme son amorce complémentaire est vers le MCS et permet d'inserer 2 nouveaux sites de restrictions.  [...] je suis bien d'accord, mais ces sites vont etre au niveau des morceaux de genes aux extremités que je ne veux pas donc certes apres restrictions ils seront amputés et donc pas fonctionnel mais il y aura toujours des morceaux donc c'est pas très propre, les deux sites uniques que j'ai mis juste pour cadrer la sequences que je veux ont ce role, d'eviter d'avoir les parties aux exterieurs.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problèmes: Recombinaison d'un plasmide

Si il n'y a pas de site de restriction utilisable encadrant ton gène, il va falloir en ajouter. On va donc ajouter 2 sites de restrictions différents de chaque côté de ton gène. Note que pour l'énoncé 1 tu peux utiliser 2 fois la même séquence de restriction car comme tu as déjà ton promoteur le sens d'insertion du gène n'a pas d'importance.  [...] Une fois ta PCR faite, tu digères tes fragments avec les 2 enzymes et pareils avec ton plasmide. Quand tu choisis tes sites il faut que tu vérifies l'ordre dans lequel les sites de restriction sont présents sur le plasmide. Dans notre cas, il faut que EcoR1 soit avant HindIII et le tout après le promoteur déjà présent sur le plasmide (sinon ton insertion se fera à l envers). Donc il faut que ton plasmide ait.  [...]

Carte de restriction de Pcr-GAI

Bon apparemment on dispose de BamHI donc dans ce cas on peut libérer le 5' GAI en utilisant HindIII et BamHI et ensuite le faire digérer séparément par XhoI et BglII si on obtient deux fragments par digestion, on a les deux sites de restriction sur le 5' GAI (donc dépend d'un coup de chance) sinon il faut (pour améliorer la carte de restriction) obligatoirement isoler le 3'GAI avec EcoRI et HindIII et le mettre en contact avec l'enzyme dont on cherche encore le site de restriction.  [...] J'ai peut être oublié de préciser que je n'ai jamais établi de carte de restriction ^^'. En fait je ne vois pas du tout comment placer les sites de restriction rien qu'en regardant une électrophorèse...Car finalement on aura des fragments de différentes tailles à mettre bout à bout mais dans quel sens.  [...]

Carte de restriction

Qu'est-ce qu'une carte de restriction Reportez les résultats sous forme linéaire en indiquant les sites de restriction pour le plasmide A et B.  [...] Je ne vois pas en quoi une représentation linéaire d'une carte de restriction diffère de celle en représentation circulaire. Prenons un exemple concret où le 1er site de restriction se situe en position 278 sur le plasmide circulaire et le second en position 778 dans le premier cas de figure.  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent Clonage

J'utilise sérial cloner, j'ai identifié les sites de restriction, mais je ne sais pas comment m'y prendre, comment choisir des oligos, introduire des sites de restriction... ETC bref je suis Out -.  [...] C'est pas détaillé mais il manque encore des infos. nature/taille de l'insert y a-t-il des sites de restriction pour le sortir de l'ancien vecteur faut-il cloner en phase avec quelque chose (Tag, protéine de fusion).  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction VS fragment d'ADN

Je pense que deux paires de bases c'est peut-être insuffisant pour permettre la digestion. j'avais l'ahabitude de mettre 4 à 5 base en amont de mon site de restriction, donnant un design d'amorce de ce genre.  [...] Voilà. l'idéal, si tu peux te le permettre, c'est avoir des sites de restriction différents sur tes amorces sens et antisens, comme ça lorsque tu fais ta ligation, pas de fermeture du vecteur sans insert, et pas df'insert dans le mauvais sens. (Je pense que ton vecteur possède un polylinker.).  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

il faut couper le vecteurs par un enzyme de restriction ensuite il faut inserer les meme sites de restriction autour de la sequence d'adn qu'on veut afin qu'on integre la sequence dans le vecteur.  [...] Hormis certaines remarques faites ci haut,on doit prendre aussi en compte le fait que le clonage depend de l'objectif du travail.Si par exemple on veur cloner l'ORF tout entier,on fait le choix de 2 sites de restriction enzymes teste au prealable car les 2 sites,il ne faut pas que ils se retrouvent dans le gene,en plus pour l'orientation du gene et aussi en fonction de disponibilite des enzymes de restriction au laboratoire.  [...]

PCR, template et riz anti-alzheimer

- pour faire cela, on prend des amorces sens et anti-sens (type AB-5'-HindIII et AB-3'-XhoI, donc entourant le gène d'intéret) contenant des sites de restrictions et on fait une PCR.  [...] 3) La découpe aux sites de restriction permet a) de récupérer le gène AB d'intérêt et b) de l'insérer dans les mêmes sites de restriction sur le plasmide commercial.  [...]