• Forum - Sites, Restriction, Phase

[Biologie Moléculaire] Beta galactosidase chez Saccharomyces cerevisiae

Autre question à l'épreuve des balles. t'es certain que ton gene beta gal est bien intégré et qu'il est en phase Pas une petite délétion due aux enzymes de restriction durant le clonage La même question vaut d'ailleurs pour ta construction. Ton récepteur est bien synthétisé, y a pas de souci de phase.  [...] Là même chose, j'ai réalisé ma construction de telle sorte à ce que mes fragments peptide promoteur, peptide signal et beta gal soient en phase, j'utilise pour celà des sites de restriction bien sûr, mais j'ai vérifier avant de faire mon clonage.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

Pour ta dernière question, il faut bien sur faire sauter le stop de la stathmine. Il y a plusieurs options. soit tu as un site de restriction bien placé, soit tu places la GFP après et tu modifie le codon stop en mutagénèse dirigée. Truc capital. les ADN codants pour ces deux protéines doivent être insérées dans le vecteur EN PHASE.  [...] Tout a fait, si tu as une carte de restriction tu peux couper a la base pres. Il faut juste avoir un site bien placé. Comme ça tu peux supprimer la fin de ton ADNc et le rabouter a ton autre gène, sous réserve de sites de restrictions bien placés sur l'un et l'autre des fragments et qui permettent un assemblage en phase.  [...]

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

Je vais cloner un gène dans un vecteur (pET21a et pGEX 4-T-2) et je vais ajouter des sites de restrictions dans mes primers avant de lancer la PCR. Quels procédures peut-on suivre pour faire introduire des sites de restrictions dans les séquences de nos oligonucléotides dans le but d'une expression dans Ecoli par exemple le sens de lecture du vecteur/lecture en phase, présence de ces enzymes dans polylinker, enzymes ne coupent notre gène.  [...] Pour introduire des amorces avec des sites de restriction en phase il faut rajouter deux nucléotides avant le site BamHI et deux nucléotides après le site de SalI ça sera comme suit.  [...]

[Biologie Moléculaire] Programme de clonage

- Deuxièmement, lui demande de construire ton plasmide. Tu lui donnes ta PCR avec les deux sites de restriction, et de l'autre ton plasmide cible avec tes deux sites. Et tu récupère la séquence totale de ton nouveau plasmide. Je ne m'embette plus à faire ça sur papier et à vérifier 20 fois si j'ai fais une erreur de phase ou autre en tapant mes séquences vu que tout est déja sur le mac.  [...] En principe (si je n'ai rien oublié) toutes les fonctions sont accessibles dans le menu général (sous les chapitres Serial Cloner, File, Edit, Sequence, Features, Restriction, Function, Window). Les plus fréquentes sont en plus disponibles en menu contextuel, en raccourci clavier et dans la barre d'outils.  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent Clonage

J'utilise sérial cloner, j'ai identifié les sites de restriction, mais je ne sais pas comment m'y prendre, comment choisir des oligos, introduire des sites de restriction... ETC bref je suis Out -.  [...] 2. Les amorces doivent couvrir combien d acides aminés de l insert Doivent ils contenir uniquement une partie de l insert et un site de restricrestriction.  [...]

Carte de restriction

Qu'est-ce qu'une carte de restriction Reportez les résultats sous forme linéaire en indiquant les sites de restriction pour le plasmide A et B.  [...] Le même exercice donnera 4 cartes avec le plasmide B. Le positionnement adéquat des 3 sites de restriction dans le plasmide B génère 4 cartes de restriction possibles dont les 3 fragments de 500, 1000 et 2000 pb permet déjà d'exclure la proposition de Naomie avec son agencement initial en 5'-2000/500/1000-3' (3 sites de restriction aux positions 1, 2000 et 2500 (ou bien aux positions 278, 2278 et 2778, comme vous voulez...)).  [...]

[Biologie Moléculaire] Fréquence de sites de restriction

Ca serait bizarre de rediviser le nombre théorique de site de restriction parla probabilité d'avoir un site de restriction. Je pense que, comme l'a dit jmbowie, il faudrait voir s(il ne faut pas considéré une digeston ménagée ou tout les sites ne sont pas clivé.  [...] * on divise le nombre total de sites de restriction (ici, on nous dit que c'est 100 pour Sau3A) par ce facteur et on aura le nombre de sites qui ne seront potentiellement pas digérés.  [...]

PCR clonage

Tu as calculé comment ton Tm pour tes amorces avec sites de restriction Tu as peut être tout simplement un problème d'hybridation de tes amorces à cause d'un Tm inapproprié.  [...] mais je comprends pas uen chose, quand on veut rajouter les sites de restriction, qu'elles sont les mesures a prendre en consideration pour ne pas tomber dans ce genre de probleme.  [...]

Y a-t-il une différence entre un spécimen ogm et un non ogm ?

Je ne sais pas pour le BT exactement comment ils on fait, mais si on se base sur les méthodes couramment utilisées, comme l'utilisation de T-DNA, plasmide Ti et agrobacterium, alors en assumant que ce peuple possède notre connaissance en biologie moléculaire, alors oui il pourra, ou du moins si ils étudient très précisement le génome, ils peuvent se demander pourquoi comme de par hasard on retrouve des clusters de sites de restriction qui encadrent la partie codante du gène, (qui sont souvent utilisés pour insérer le gène dans le plasmide afin que la bactérie transmette ce gène, les plasmides possèdent plusieurs sites pour laisser l'experimentateur choisir l'enzyme qu'il veut pour ouvrir le plasmide et insérer le gène dedans).  [...] ps. dans le pire des cas, on peut toujours, une fois le transgène intégré, induire des InDels dans nos sites des restriction histoire d'effacer les traces (non). Donc j'ajoute cette condition à ma question. une seule manipulation doit être réalisée, donc seulement l'intégration du transgène (pas de manipulations ultérieures pour effacer les traces).  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

2-Les sites de restriction doivent être localisé sur un marqueur de séléction. Donc si je prends comme exemple le vecteur pBR322, je peux utuliser les enzymes de restriction marquees sur la carte du vecteur, qui sont dans ce cas. PvuII, Sty I, BstZ I, Sal I, Sph I, BamH I, EcoR V, Hind III, EcoR I, Sca I, PvuI, PstI.  [...] Hormis certaines remarques faites ci haut,on doit prendre aussi en compte le fait que le clonage depend de l'objectif du travail.Si par exemple on veur cloner l'ORF tout entier,on fait le choix de 2 sites de restriction enzymes teste au prealable car les 2 sites,il ne faut pas que ils se retrouvent dans le gene,en plus pour l'orientation du gene et aussi en fonction de disponibilite des enzymes de restriction au laboratoire.  [...]