• Forum - Sites, Extrémités, Clonage

plasmide et BAMH1

1) Quels sont les sites devant être présents aux 2 extrémites du gène pour pouvoir réalise le clonage.  [...] Tu as un plasmide recombinant donc il possède le gène. Une fois qu'on l'a, on met l'enzyme Bam H I. Sur le plasmide recombinant il y a donc 3 sites de restriction Bam HI. celui du plasmide seul et les 2 du gène qui est dans le plasmide. Donc trois coupures.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

Si tu mets 1 unité d'enzyme et que la réaction fonctionne à 100%, tu auras 1microgramme de digéré. Je te conseille de mettre plutôt 2 unités avec 10 microlitres de ton plasmides (1,5mg), tu devrais avoir largement assez de matériel pour le clonage qui suit.  [...] Je vais donc faire une digestion en 2 lots. l'un avec NcoI, l'autre avec BamHI. Après le gel, j'inverse les lots et les digère avec l'autre enzyme. Enfin, clonage. je vais commencer par cloner le bout Cter contenant le site BamHI, puis je clonerai le Nter entouré par les deux extrémités NcoI.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

- J'ai eu le cas d'une agarose contaminée par je-ne-sais-quelle-nucléase qui transformait mes extrêmités cohésives en extrêmités nettes. Quand je purifiais sur gel après digestion, je perdais ainsi mes extrémités cohésives. Suppriemr cette étape de purification a sauvé mon clonage.  [...] D'une part j'utilise pacI (clonage generant des extrémités compatible) et d'autre part EcoRI / Not1 (genere des extrémités non compatible).  [...]

[Biochimie] Topoisomérase et kit " TA cloning" ...

Je ne comprends pas le rôle de la topoisomérase dans le kit de TA cloning qui permet de créer des extrémités cohésives sur un vecteur de clonage..( ajoute un T aux extrémités du vecteur, et un A aux extrémités du produit PCR à inserer dans le vecteur ).  [...] La topoisomérase est liée de façon covalente au vecteur, ce qui le rend plus réactif. L'activité catalytique de cette enzyme n'est pas exploitée, seulement sa capacité à se lier aux nucléotides.   [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage orienté, design d'amorces

..). Car le sous-clonage (vecteur de propagation ) permet d'avoir une grosse quantité de son insert, propre, et avec les extrémités adéquates pour ensuite refaire un clonage mais dans le vecteur d'expression de la future protéine recombinante.  [...] Moi je fais jamais de sous clonage, je clone direct dans le plasmique d'intérêt. Il suffit de dessiner tes amorces en conséquence.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage - Page 2

donc l'objectif etait de faire une amorce sens a gauche en inserant un site de restriction une amorce qui est vers le MCS mais là elle permet d'apporter 2 sites de restrictions et de l'autre coté faire une amorce sens a droite en inserant un site unique (les deux inserts ont donc a leurs extremités un site unie et au milieu au refait un MCS) et de meme son amorce complémentaire est vers le MCS et permet d'inserer 2 nouveaux sites de restrictions.  [...] Tout simplement car il n'y a aucuns sites de restrictions (qui puissent convenir) aux alentours...les deux sites de restrictions que j'ai besoin de placer aux extremités servent a isoler les cassettes que j'ai besoin de recuperer si je m'ecarte je vais amplifier au passage donc des parties que je n'ai pas besoin et qu'il me sera dur d'enlever apres.  [...]

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

Il ne faut pas oublier d'ajouter des nucléotides supplémentaires aux extrémités des oligos si on veut etre certains que les sites soient coupés.  [...] Yoyo je suis d'accord concernant les nucléotides supplémentaires et aussi sites présents dans le polylinker mais j'arrive pas à comprendre en phase avec le codon ATG du plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation

est- ce - que tu as procédé à une déphosphorylation de l'extrémité 5' de ton plasmide digérée l'utilisation d'une phosphatase alcaline est necéssaire dans l'étape qui précède la ligation puisque tu utilises un seul enzyme de restriction... car au moment de ligation il va être plus facile à un plasmide de se recirculariser plutôt qu'intégrer une autre séquence.  [...] Refait le clonage à partir de ton fragment sorti de PCRTopo mais sans déphosphorylé ton plasmide. La CIP ou la shkink abime parfois les extrémités de l'ADN rendant impossible toute ligation.  [...]

Structure d'un phage

Mais ou se trouve la fameux site cos qui rend possible l' empaquetage de l'ADN dans la capside et à quoi sert t il dans le clonage.  [...] Les sites COS sont de l'ADN, ce sont les deux extrémités simple brin de génome phagique. Et le génome est dans la capside.  [...]

[Biologie Moléculaire] Principe des banque génomique/cDNA

On ne parle pas de dégradation par des enzymes de restriction, mais de digestion. La différence est quand même notable. avec le terme dégradation je signifie le fait que je pars d'une macromolécule (ADN) pour me retrouver avec des nucléotides à la fin. Alors que le terme digestion signifie que je vais couper à certains endroits pour me retrouver avec des fragments de tailles différentes.   [...] Etant donné que les sites EcoRI sont un peu partout au sein de ce génome, on se retrouvera avec des bouts de tailles différentes, ayant tous le même type d'extrémités. celles générées par EcoRI.  [...]