• Forum - Sites, Digestion, Enzyme, Restriction

[Biologie Moléculaire] Calcul de rendement

Bonjour. Voilà en ce moment je réalise des TP de biomoléculaire. On me demande de réaliser un calcul de rendement de purification des fragments obtenus lors d'une digestion. pCR-GAI digéré avec BamH1 et Hind III, 2 sites de restriction pour chaque enzyme.  [...] Sachant que Rendement = (Concentration après purification) / (concentration avant purification), il me manque donc la concentration avant. On connait la concentration d'ADN (donc celle du plasmide) présente initialement. Cependant, pour connaitre celle des fragments présents (donc l'extrémté 5', après digestion) j'essaye cette formule. (Concentration ADN * (784/5484)). Donc.  [...]

Hydrolyse totale et hydrolyse partielle de l'ADN

je veux savoir quelle est la différence entre hydrolyse totale et hydrolyse partielle de l'ADN et on joue avec quels facteurs et merci bcp.   [...] Si vous voulez parler de digestions totales et partielle par des enzymes de restriction, alors c'est le fait de ne pas couper tous les sites présents en jouant sur la quantité d'enzyme et le temps de digestion. Sinon je ne vois pas.  [...]

[Biologie Moléculaire] plasmide recombinant et ADN ligase

j'ai un TP de digestion enzymatique et je suis bloquée sur une question concernant la circularisation d'un fragment d'un plasmide (ce dernier a été hydrolysé par l'enzyme de restriction Agel,ensuite incubé avec la klénow en présence de 4 dNTP, ensuite digéré par EcoRV puis son plus grand fragment contenant 2 sites BglII est purifié).  [...] comment recirculariser ton gros fragment pour former un nouveau plasmide. D'un côté tu as une partie du site de restriction AgeI, et de l'autre tu as une partie du site de restriction de EcoRV. Tes bouts sont entiers... (tu n'as pas de sticky ends ) Alors, quelle enzyme catalyse la ligation de deux fragments d'ADN.  [...]

Clonage orienté

Si c'est bien le cas, cela signifie que tu ne peux pas utiliser SacII pour le clonage. En effet, le clonage va consister à amplifier ton insert avec des oligos de PCR portant des sites de digestion aux enzyme de restriction voulues. On ne veut donc pas que la digestion en question coupe ton insert en deux.  [...] Après PCR, il faut digérer l'insert d'une part, et le plasmide d'autre part. Ces digestions vont permettent de générer des bouts cohésifs entre l'insert et le plasmide. Il suffit alors de choisir deux enzymes de restriction (peu importe lesquelles a priori).  [...]

PCR, template et riz anti-alzheimer

- pour faire cela, on prend des amorces sens et anti-sens (type AB-5'-HindIII et AB-3'-XhoI, donc entourant le gène d'intéret) contenant des sites de restrictions et on fait une PCR.  [...] tu verras qu'il y a plusieurs sortes de produit d'amplification. il y a effectivement des produits très longs mais en raison de la taille des cycles et du fait qu'ils ne sont pas majoritaires, on considère que le produit d'une PCR est un brin qui fait la taille de ce qu'il y a entre les deux amorces.   [...]

microbiologie - CARTE DE RESTRICTION

prends ton plasmide et effectue des digestions avec une enzyme de restriction particulière (eco R1 par exemple) ensuite fait ton gel et fait migrer ton produit de digestions.  [...] Maintenant la méthode. elle est basée sur la taille des fragments de restriction, c'est-à-dire sur la taille des morceaux d'ADN obtenus après digestion.  [...]

[Biochimie] Mapping et Bal 31

This degradation is accomplished without the introduction of detectable scissions away from the ends of the duplexes. When this nuclease is used to produce a series of progressively shortened samples from a linear duplex DNA, subsequent digestion of these samples with a site-specific restriction endonuclease and analysis of the resulting fragments by gel electrophoresis permits the rapid establishment of the order of the restriction enzyme fragments through the entire genome.  [...] This is accomplished by noting from the electropherograms the order in which the various restriction enzyme fragments become noticeably shortened or disappear. Using this method, the five cleavage sites for the endonuclease Hpa I and the single cleavage sites for the nucleases Hpa II and Pst I have been mapped in PM2 bacteriophage DNA.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

J'imagine que tu dessines tes amorces en incluant les sites de restriction. Rajoutes-tu des nucléotides supplémentaires sur ces primers (les sites de restriction aiment bien être entourés pour une bonne digestion).  [...] Comment fais tu ta digestion En rajoutant toute la quantité d'enzyme d'un coup Moi, je diminue la quantité d'enzyme par deux et j'en rajoute à la moitié du temps de digestion pour diminuer son essoufflement.  [...]

Enzyme de restriction et activité étoile!

L'activité étoile survient lorsqu'une digestion ne se produit pas dans les conditions optimales de l'enzyme. L'enzyme se met à couper a peu près partout et son site de restriction, souvent, se raccourci et l'enzyme produit plus de fragments que supposé. Ma question est, disons qu'une enzyme produit des extrémités 5' cohésives théoriquement, est-ce qu'elle va continuer de produire des extrémités 5' cohésives même si elle est dans des conditions d'activité étoile.  [...] Sinon, si l'objectif est de n'obtenir que des fragments à bouts cohésifs, c'est une autre paire de manche (pourquoi ne pas essayer une digestion partielle). Ou un clonage qui permettent d'insérer un site de restriction plus commun.  [...]

[Biochimie] Preparation et analyse de plasmides

Sinon, la digestion c'est quand tu mets ton enzyme dans le mélange réactionnel et que tu attends un pitit moment pour qu'elle agisse (faut-il qu'elle parcoure la chaîne de caractères et trouver la regexp qui match quoi). Il faut donc que d'une façon ou d'une autre, on teste le succès de la chose.  [...] donc, avant digestion, on regarde la tête de l'ADN *non digéré* sur gel. Après digestion, on compare. si notre ADN a la même tête, c'est FAIL. si on a des bandes qui correspondent à ce qu'on a calculé d'après les positions des sites de restrictions (les regexp), c'est PASS.  [...]