• Forum - Site, Restrictions, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Je dispose de deux enzymes de restrictions, une XhoI qui possède deux site de restriction dans la cassette de polyclonage. l'autre enzyme est MluI cependant sur le schema du plasmide je n'ai pas son site de restriction donc je ne sais pas ou elle coupe.  [...] oui tu peux, sous certaines conditions. Il faut un site de restriction dans le vecteur, et un autre dans l'insert (pas au milieu de l'insert). Selon que l'insert est dans un sens ou dans l'autre, tu auras deux fragments différents en taille. Pour l'histoire du plasmide natif j'aurais dit que c'etait le vecteur seul.  [...]

Problème lors de ligation

J'ai un plasmide pcDNA3 contenant un insert qui est situé entre deux sites de restrictions Xho I, je digère ce plasmide avec l'enzyme Xho I puis je fais migrer dans un gel TAE 1% avant de récupérer mon insert et mon plasmide ouvert ( grâce à un kit wizard).  [...] Le deuxième vrai soucis c'est qu'après l'extraction de plasmide (après repiquage des colonies en milieu liquide) je redigère pour vérifier que tout a bien fonctionné et la j'obtiens un smir.  [...]

Déchiffrage d'une carte de plasmide

Les 2 lignes au dessus du plasmide correspondent aux différents sites de restrictions (éventuellement pour cloner une séquence dans ces poly-linker).  [...] La séquence de polyadénylation BGH est située juste derrière les sites de restriction ce qui permettra à ta séquence insérée de recevoir une queue polyA et tu obtiendra un ARNm fonctionnel (=traductible en protéine).  [...]

Fabrication banque ADNc

Après action de la reverse transcriptase, puis traitement alcalin pour détruire l'ARNm matrice, on se retrouve avec un simple brin d'ADNc.   [...] C'est après action de la nucléase S1 qu'on ajoute (à l'ADNc) deux sites de restrictions spécifiques du plasmide dans lequel on veut introduire l'ADNc.  [...]

[Génétique] Question qui me tracasse beaucoup ( information génétique )

L'ADN recombinant le but est de prendre un gène (ou une version-. allèle) et de le multiplier afin de pouvoir dans un second temps travailler dessus (séquencage par exemple). Donc à l'aide d'enzymes de restrictions qui reconnaisses certains sites (suite de nucléotides) on va couper le plasmide afin d'insérer notre gène.  [...] Il faudra bien choisir les enzymes de restrictions selon le plasmide mais également leurs séquences (par rapport à notre gène) car on va l'insérer grâce à la complémentarité des bases.  [...]

[L1 BIO] TP Biologie moléculaire

Du coup je comprend vraiment pas.Le gène total de la GFP fait 717 paires de bases,si le deuxième site de restriction Xho1 était à mettre dans sa totalité il serait à 947 paires de bases,ce qui collerait plus au niveau de la visualisation par electro,mais du coup j'aurais un problème pour recalculer la taille totale du plasmide recombinant.  [...] La carte, c'est l'interprétation que tu en fais, c'est-à-dire la disposition des différents sites de restrictions sur ton plasmide avec la distance séparant chacun des sites que tu as placé.  [...]

[Biologie Moléculaire] hydrolyse du plasmide avec des enzymes de restrictions EcoR1 et Hind3

bonjours a tous je voudrais de laide a propos d'un TP qu'on a fait en biomol en fait on a pris un eppendorf avec dedans plasmide purifié+EcoR1+tampon+eau et on a incuber a 37°C ce que je voudrai savoir c'est linteret de cette incubation.  [...] EcoRI est une enzyme de restriction =. ça va couper ton plasmide en faisant de sticky ends et tu vas pouvoir mettre quelque chose dedans à condition que cette séquence ait les mêmes sticky ends.  [...]

[Génétique] clonage orienté ou non

ici le plasmide a deux sites de restrictions différents mais identiques aux deux sites de reastriction de l'insert je ne sais pas si j'ai été claire en gros.  [...] Si tu sort ton insert par restriction, j'imagine que tu dois pouvoir trouver un site de restriction qui te detruise ton plasmide donneur. Mais il sera toujours preferable de bien purifier ton insert sur gel pour te debarasser au maximum du plasmide donneur.  [...]

[Biologie végétale] Compréhension d'un article sur les OGMs

Pour moi, pour générer un OGM, on devait ajouter ou utiliser des sites de restrictions déjà présent et cliver ces derniers par une enzyme de restriction (ER) d'une part dans le gène d'intérêt que l'on veut ajouter dans l'OGM et d'autre part dans le plasmide ou vecteur qui transportera ce gène d'intérêt.  [...] Et donc, une fois obtenu notre gène d'intérêt en surproduction et purifié, c'est celui là qu'on est censé reprendre en 2.4 pour la suite de l'analyse, sinon le 2.2 aurait été inutile Ensuite on reprend donc la séquence qu'on amplifie de nouveau en PCR pour y introduire de nouveaux sites de restriction et recréer un vecteur qui sera cette fois inséré dans le tabac par la technique leaf disk (si j'ai bien compris).  [...]

[Biochimie] clonage

Non pas nécessairement. Si les deux sites de restrictions sont dans la cassette de clonage (ce qui doit être le cas), alors on retire entre 10 et 50 pb que l'on ne verra pas sur gel. Le plasmide semblera simplement linéarisé.  [...] D'où proviennent les sites de restrictions de vos inserts Sont-ils sur les oligos Si oui, avez-vous contrôlé qu'ils soient corrects Toujours dans la même optique, si les oligos sont corrects en théorie, ont-ils été purifiés HPLC Il peut toujours y avoir eu une erreur à la synthèse.  [...]