• Forum - Site, Restriction, Vecteur

[Génétique] les vecteurs

s'il vous plait est ce que le site de restriction (au niveau du vecteur) = site d'insertion d'une séquence d'un gene (resistant à l'antibiotique par expl).  [...]

Clonage par PCR

J'ai une petite question... j'aimerais savoir a quoi correspond exactement l'expression clonage par PCR. Est-ce quand on ajoute en 5' de l'amorce la sequence specifique d'un site de restriction, ce qui permet ensuite de liger le produit de pcr dans un vecteur contenant le meme site de restriction (en resume) Ou bien est-ce autre chose.  [...] Je pense qu'il s'agit tout simplement d'un clonage à partir d'ADN que tu as amplifié par PCR q'il s'agisse d'une ligation après digestion enzymatique ou autre.   [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

il faut couper le vecteurs par un enzyme de restriction ensuite il faut inserer les meme sites de restriction autour de la sequence d'adn qu'on veut afin qu'on integre la sequence dans le vecteur.  [...] J'ai moi aussi de la difficulté a trouver un vecteur approprié, Et Je ne comprend pas pourquoi le bon vecteur dans cet exemple serait PinPoint xa-1 Selon ce que j'ai vu il ne possede pas de sites de restriction communs avec la sequence d'ADNc dans sa region du gene de resistance Je ne comprend pas d'ailleurs pk le site de restriction doit se trouver dans la sequence de resistance a l'antibiotique et non ailleurs dans le plasmide.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

Pour ta dernière question, il faut bien sur faire sauter le stop de la stathmine. Il y a plusieurs options. soit tu as un site de restriction bien placé, soit tu places la GFP après et tu modifie le codon stop en mutagénèse dirigée. Truc capital. les ADN codants pour ces deux protéines doivent être insérées dans le vecteur EN PHASE.  [...] Je ne sais pas quel vecteur tu veux utiliser, mais il existe des centaines de vecteurs commerciaux qui comportent tout ce qu'il faut, dont un MCS ( multi cloning site ) entre le promoteur et le terminateur. Ce site contient une grande quantité de sites de restriction et permet d'insérer facilement ce que tu veux. (voir image).  [...]

transgénèse végétale

Dois-je prendre des primers qui ont un site de restriction bien spécifique pour pouvoir mettre l'ADN amplifié dans le vecteur ti désarmé après Quel doit être la longueur du primer environ.  [...] Le promoteur 35S faut-il que je le clone aussi dans le vecteur ou est il généralement déjà dans les plasmide ti désarmé avec un site polylinker Si quelqu'un connait un site ou il y a un schéma ce serait super.  [...]

[Biologie Moléculaire] Meilleure résolution pour gel d'agarose

J'ai commandé un gène dans un plasmide avec les site de restriction qui vont bien de chaque côté et comme j'ai beaucoup de chance, il se trouve que le vecteur qu'il m'ont envoyé contient également ce fameux site de restriction. Je me retrouve du coup avec 3 bandes au lieu de 2 sur mon gel après digestion.  [...] Une autre solution vient de me traverser l'esprit. faites une mutagénèse du site de restriction qui vous embête pour le flinguer.  [...]

PCR problème de poids moléculaire

Alors voilà j'ai reçu un plasmide d'un collaborateur contenant une séquence qui m'intéresse. Je dois récupérer cette séquence pour la sous-cloner dans un autre vecteur. J'ai donc designé 2 primers contenant le début ou la fin de ma séquence + un site de restriction enzymatique.  [...] Le problème est qu'après PCR j'obtiens un fragment à environ 3500pb au lieu des 2300 attendues. Après avoir essayé différentes températures d'hybridation, différentes TAQ… j'ai fini par envoyer à séquencer et pas de problème la séquence voulue est bien là… donc j'ai designé de nouveaux primers car les premiers avaient un Tm très différent, et après PCR je retombe encore sur cette bande trop haute + une bande vers 750, comme avec les précédents primers.   [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

L'objectif de ce clonage est de récupérer une partie d'un vecteur, pour se faire une amorce foward a été faite pour pouvoir intégrer un nouveau site de restriction, l'amorce reverse elle doit intégrer plusieurs sites, l'insert que l'on doit obtenir doit faire environ 1500-1600bp.  [...] Franchement si ça déconne arrêtez de perdre du temps et faites synthétiser la séquence. Pour 1500pb il y en a pour 500¬, c'est vraiment rien. Et en plus vous pourrez vous amuser à mettre sites de restrictions, mutations, etc, ou vous voulez et à votre convenance.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sequence a ajouter avant un site de restriction

Il me semble qu'il est préférable d'ajouter quelques bases avant (dans le cas du 5') et après (pour le 3') les sites de restriction afin que l'enzyme puisse cliver les extrémités de l'amplicon.  [...] Je ne pense pas qu'il y ait une séquence type, veillez juste à conserver un %GC correct et a ne pas créer de site de restriction qui serait ennuyeux par la suite.  [...]

[Microbiologie] Taille de plasmide

j-ai les enzyme de restriction BamHI,EcoRI et PstI,COMMENT SAVOIR ESQ CES ENZYMES ONT DES SITES DE RESTRICTIONS POUR LE PLASMIDE pGEM-T ET SI C-EST OUI COMBIEN DE SITE SVP DES REPENCES SONT LES BIENVENUE.  [...] C'est facile pGEM-T est un vecteur de sous-clonage commercial. La carte plasmidique est disponible sur internet. A partir de là un enfant de 6 ans trouverai le nombre de site de restriction pour ces 3 enzymes.  [...]