• Forum - Site, Enzymes, Restrictions

[Biologie Moléculaire] activite enzymes de restrictions

afin de réaliser une banque de fragments d'ADNg double brin, on dispose de 20 µg d'ADNg que l'on digère par les enzymes de restrictions BaeGl ou Alul. Chacune de ces enzymes possède une activité de 10U/µL (1U coupe totalement 1µg de plasmide de 3000pb possèdant un site unique de restriction pour l'enzyme de restriction considéré en 1h à 37°C).  [...] 1) si la présence de site de restriction est aléatoire, expliquer en détaillant les calculs, combien de site de restrictions sont théoriquement présent sur ces 20µg d'ADN pour chacune de ces enzymes.  [...]

Clonage orienté

Je suis bloquée, j'ai un peu de mal avec les enzymes de restrictions et je comprend pas tout à fait ce que l'on me demande. Sachant que l'on veut un clonage orienté, on me demande de choisir les enzymes de restrictions utilisable du côté de la bordure portant la séquence du promoteur T7 sachant que le fragment d'intérêt contient un site SacII.  [...] Après PCR, il faut digérer l'insert d'une part, et le plasmide d'autre part. Ces digestions vont permettent de générer des bouts cohésifs entre l'insert et le plasmide. Il suffit alors de choisir deux enzymes de restriction (peu importe lesquelles a priori).  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage par PCR taille des amorces

Je me demandais donc la taille que devait faire mes amorces de PCR, et si je dois prévoir quelques bases entre le début (et la fin) de ma séquence codante et mon site de restriction. Car je me demandais si en juxtaposant les 2 sans rien ajouter entre, est ce que la coupure/ligation ne va pas endommager ma séquence codante.  [...] En revanche on conseille de rajouter quelques bases entre le le site et l'extrémité 5' de façon à internaliser le site car les enzymes de restrictions sont des ENDOnucléases, il faut que leur cible soit au milieu.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Je dispose de deux enzymes de restrictions, une XhoI qui possède deux site de restriction dans la cassette de polyclonage. l'autre enzyme est MluI cependant sur le schema du plasmide je n'ai pas son site de restriction donc je ne sais pas ou elle coupe.  [...] oui tu peux, sous certaines conditions. Il faut un site de restriction dans le vecteur, et un autre dans l'insert (pas au milieu de l'insert). Selon que l'insert est dans un sens ou dans l'autre, tu auras deux fragments différents en taille. Pour l'histoire du plasmide natif j'aurais dit que c'etait le vecteur seul.  [...]

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

Je vais cloner un gène dans un vecteur (pET21a et pGEX 4-T-2) et je vais ajouter des sites de restrictions dans mes primers avant de lancer la PCR. Quels procédures peut-on suivre pour faire introduire des sites de restrictions dans les séquences de nos oligonucléotides dans le but d'une expression dans Ecoli par exemple le sens de lecture du vecteur/lecture en phase, présence de ces enzymes dans polylinker, enzymes ne coupent notre gène.  [...] Ce n'est pas bien compliqué dans le principe, il s'agit simplement de designer, disons les 20 premières bases de votre séquence et de coller un site de restriction devant. Comme les enzymes de restrictions sont des endonucléases, il faudra aussi bien penser à mettre 6 bases en amont.  [...]

[Biologie Moléculaire] Rflp

Pour la technique RFLP, tu utilise des enzymes de restrictions,ça marche dans le cas ou tu as des rflp,c'est à dire des SNP(single nucleotide polymorphism) qui sont dans un site de restriction.ainsi, selon l'allèle, l'enzime clivera ou pas son site, ce que l'on observe par migration sur gel.  [...] D'accord merci donc si je comprend bien la technique du southern blot ne demande pas forcément de cliver les brins par une enzyme de restriction. La sonde peut hybrider directement les brins d'adn dans ce cas.  [...]

[Microbiologie] Taille de plasmide

j-ai les enzyme de restriction BamHI,EcoRI et PstI,COMMENT SAVOIR ESQ CES ENZYMES ONT DES SITES DE RESTRICTIONS POUR LE PLASMIDE pGEM-T ET SI C-EST OUI COMBIEN DE SITE SVP DES REPENCES SONT LES BIENVENUE.  [...] C'est facile pGEM-T est un vecteur de sous-clonage commercial. La carte plasmidique est disponible sur internet. A partir de là un enfant de 6 ans trouverai le nombre de site de restriction pour ces 3 enzymes.  [...]

[Génétique] Construire un vecteur de transgenèse dérivé des transposons

Pour ce faire nous allons réaliser une PCR du gène Tet avec deux amorces contenant des sites de reconnaissances pour les enzymes de restriction XbaI et HindIII. Visiblement les amplicons obtenus possèdent à chaques extrémités le site de reconnaissance pour ces enzymes de restrictions et une Adénosine (d'ailleurs là j'ai pas compris d'où elle vient).  [...] 3-On introduit les enzymes de restrictions XbaI et HindIII. on va avoir le fragment Tet qu'on va ensuite insérer dans pBCKs+.  [...]

Enzymes de restriction

Bonsoir, lorsque l'on veut étudier les ARN ribosomaux, ou d'autres séquences, pourquoi utilise t-on plusieurs enzymes de restrictions Je sais que chaque enzyme a un site de restriction spécifique mais je n'arrive pas à comprendre l'utilité de cette technique.  [...] On étudie l'ADN 16s par PCR, puis électrophorèses des fragments d'ADN obtenus grâce aux enzymes. On a alors les résultats de l'électrophorèse (pour une bactérie) avec différentes enzymes de restrictions. Puis on nous demande l'intérêt de la technique puis pourquoi il est intéressant d'en utiliser plusieurs.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

3) Si mes primers les plus extrèmes contenant les sites de restriction uniques du plasmide ont leur séquence commençant directement par ces sites de restriction uniques, y a t-il trop de risques qu'ils soient modifiés (et donc que je perde mes sites de restriction) par une enzyme qui perdrait de sa fidélité justement là où je veux pas.  [...] La plus part des enzymes de restrictions ont besoin de quelques bases de part et d'autre du site pour se fixer a l'ADN si ton site est exactement a l'extremité de l'ADN beaucoup d'enzyme ne couperont pas du tout. ca va etre super galere.  [...]