• Forum - Séquences, Sites, Restriction, Sens

[Biologie moleculaire] pb clonage : Klenow

...a 670-bp PvuII fragment of plasmid1 was cloned into plasmid2. This fragment was ligated into plasmid2 which had been digested with EcoRI and filled in with Klenow fragment. The filled in EcoRI-PvuII junctions regenerate EcoRI sites.  [...] J'ai retourné les séquences des sites de restriction dans tous les sens mais je ne vois pas comment on peut reconstituer un site EcoRI comme ça... est-ce que je me trompe Je ne connais pas très bien cette reaction de fill-in, peut-être que je me trompe dans mon raisonnement.  [...]

[Biologie Moléculaire] polymorphisme de restriction

C'est une séquence de l'ADN qui peut être reconnue par une enzyme de restriction. Les enzymes de restriction sont des protéines capables de reconnaître ces sites et de couper l'ADN à ce niveau. Les sites de restriction ont la particularité d'être des site palyndromiques, c'est-à-dire qu'ils sont les mêmes dans un sens ou dans l'autre.  [...] En lisant cet article, vous comprendrez d'une petite modification de la séquence d'ADN peut faire apparaître ou disparaître un de ces sites de restriction, et que ce phénomène peut être exploité pour détecter ces polymorphismes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problèmes: Recombinaison d'un plasmide

Si il n'y a pas de site de restriction utilisable encadrant ton gène, il va falloir en ajouter. On va donc ajouter 2 sites de restrictions différents de chaque côté de ton gène. Note que pour l'énoncé 1 tu peux utiliser 2 fois la même séquence de restriction car comme tu as déjà ton promoteur le sens d'insertion du gène n'a pas d'importance.  [...] fin de ta sequence-HindIII-NNNN), ceux ci désignent des bases qui peuvent éventuellement séparés les 2 sites de restriction sur ton plasmide qui ne sont pas forcément côte à côte.  [...]

Comment orienter un fragment d'adn dans un vecteur

Donc pour cela je suppose qu'on peut utiliser des primers avec une partie 5' non complémentaire qui permet de générer un site de restriction différent selon le côté du fragment ce qui permet d'introduire le fragment dans le bon sens en utilisant les 2 sites différents.  [...] L'utilisation de sites de restriction est le seul moyen pour faire cela. Une autre solution est de ne pas orienter le fragment, et une fois le clonage fait tester les plasmides pour trouver ceux qui auront un insert dans le bon sens. Apres tout tu as 50% de chance que ton insert soit dans la bonne orientation.  [...]

Déchiffrage d'une carte de plasmide

La séquence de polyadénylation BGH est située juste derrière les sites de restriction ce qui permettra à ta séquence insérée de recevoir une queue polyA et tu obtiendra un ARNm fonctionnel (=traductible en protéine).  [...] Juste avant les sites de restriction tu as bien sûr un promoteur pour initier la transcription de ta séquence (Pcmv). Les séquences Ori sont les origines de réplication du plasmide.  [...]

[Biotechnologie] Que veut dire ... ?

en rajoutant certains nucléotides a tes amorces (qui representerons les extrémités de tout ce que tu auras amplifié) tu auras donc ajouté des petites séquences de part et d'autre de ton gène,  [...] grace a ces séquences de restriction, et sous l'actions d'enzymes de restrictions ou de ligases, tu pourras intégrer la sequence que tu as amplifié, à l'interieur d'un vecteur, ou au contraire l'en extraire.  [...]

[Génétique] Questions à propos de la thérapie génique

Ce document parle aussi de gènes de sélection qui contiennnent des sites de restriction () mais je ne pense pas que ce soit de notre niveau.  [...] Concernant les sites de restriction, ce sont des séquences d'ADN double brin qui sont reconnues et clivées par des enzymes bactériennes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

En repartant du début, tu as fait une PCR et inséré ton produit de PCR dans le pGEM-T, transformé des bactéries et ensuite fait des minipreps. As tu séquencé à ce moment là As tu inséré les sites de restriction par PCR ou alors utilisé les sites de ta séquence.  [...] Effectivement j'ai envoyé à séquencer après midipréparations les séquences étaient cohérentes, par PCR j'ai inséré les sites de restriction.  [...]

PCR et plasmide-protocole article scientifique en anglais (dsl) non compris help!!!

The expression vector was used to transform BL21 DE3 cells (Invitrogen). Transformants were selected on LB medium plates containing 50 ¼g ml1 ampicillin, and the sequence was confirmed by DNA sequencing, which was carried out using the dideoxychain-termination procedure developed by Genome Express.  [...] En survolant rapidement, il m'a semblé comprendre que c'est un premier plasmide qui te premet ensuite d'inserer plus facilement ton fragment d'interet dans tout types de vecteurs d'expression, sans avoir à te preoccuper de choisir tes sites de restriction, et de reflechir au sens.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

est-ce que je dois essayer de trouver les sites de restriction des enzymes des vecteurs dans la sequences du ARNm et choisir le vecteur qui contient le plus d'enzymes dont les sites de restriction on ete trouve dans l'ARNm.  [...] (pour verifier cela, j'ai utulise NEBcutter v2.0 (cliquer sur le mot pour aller au logiciel, pour proceder, j'ai copier ma sequence d'adn la-bas ensuite j'ai cliquer sur submit et j'ai obtenue tout les sites de restriction)).  [...]