• Forum - Séquence, Protéine, Vecteur

Créer une protéine taguée NLS

J'ai ma séquence codant ma protéine dans un vecteur A. je suis capable de la sortir.  [...] Quelqu'un connait-il un vecteur avec un tag NLS dans lequel je pourrai rentrer la séquence codant ma protéine Puis-je acheter directement le TAG.  [...]

[Biologie Moléculaire] co transfection??

Vous transfectez votre vecteur codant pour votre facteur de transcription avec un autre vecteur portant, lui, une séquence promotrice sur laquelle peut se fixer votre protéine d'intérêt et codant pour une protéine rapportrice dont vous quantifierez la présence de la manière qui vous semblera la plus appropriée (dosage d'activité enzymatique, ELISA, réaction colorée, etc...).  [...] -en même temps on transfecte une construction permettant l'exxpression d'une protéine permettant de transformer un composé Y en luimière B, expression dépendant du promoteur que tu veux étudier.  [...]

[Immunologie] Fixation pour immonofluorescence

Je sais que la GFP est compatible avec la fixation des cellules, mais cela dépend peut-être de la protéine à laquelle elle est taggée. D'autre part, ici tu utilises des formes modifiées de la GFP, as-tu regardé dans des publications si de l'observation de fluorescence sur cellule fixées a été réalisé avec ces marqueurs fluorescents.  [...] Je vais surement dire quelque chose de tres tres bete, mais je lisais ce que tu avais ecrit, et qq chose a du m'echapper... Si tu réalise un immunomarquage de tes tag sur vecteur vide c'est normal que tu n'ais pas de marquage nan ton tag etant lié a ta sequence codante, sans sequence codante pas de tag.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteurs de clonage

Vous désirez produire cette protéine dans les bactéries afin de pouvoir étudier ses propriétés en laboratoire. Lequel des types de vecteurs suivants choisirez-vous.  [...] Vous devez pouvoir produire la protéine, ce qui signifie que la séquence codante va être transcrite et traduite. Le traduction va s'opérer grâce à la machinerie bactérienne, pas de souci. En revanche, la transcription va nécessiter la présence d'un promoteur sur le vecteur, c'est la première chose que vous devez chercher.  [...]

[Biologie Moléculaire] D'une protéine à un gène à une protéine

En revanche, il est possible de synthétiser l'ADN correspondant à la protéine séquencée. Cela s'appelle la méthode des gènes synthétiques. Il suffit de prendre des amorces recouvrant toute la séquence voulue. Les amorces sens et anti-sens s'hybrident en partie sur toute la séquence d'intérêt, on met une Taq sans activité 5'-3' exonucléase qui va combler les espaces.  [...] On met ensuite une ligase qui va joindre les différents fragments entre eux. on a alors une séquence double brin d'ADN qui contient l'information génétique de la protéine voulue. Ensuite il faut insérer cette séquence dans un vecteur d'expression. Donc on aura pensé à ajouter des sites de restriction de part et d'autre du gène synthétique pour pouvoir l'insérer dans un vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Binding tests sur enzyme

J'ai aussi pensé à utiliser les tests de binding classiques mais il faut que les protéines soient membranaires. J'ai donc cherché comment amener mon enzyme à la membrane (création d'une protéine chimère), mais je ne trouve rien. Il doit pourtant exister un vecteur avec une séquence signal et une suite d'acides aminés aliphatiques permettant l'expression membranaire de mon enzyme.  [...] Un test de binding sur cellule entière ou sur membrane isolée, c'est des étapes et des étapes (lavage, fixation...), des soucis de reproductibilité avec des lots de cellules qui vont produire plus ou moins de protéines, des soucis de sensibilité avec beaucoup de non-spé lié a l'absorption des molécules aux membranes.  [...]

[Biologie Moléculaire] vecteur de clonage et le vecteur d'expression

svp quelle est la difference entre le vecteur de clonage et le vecteur d'expression à part que l'un a un promoteur et pas l'autre.  [...] Un vecteur d'expression est un vecteur dans lequel on va cloner le même fragment d'ADN après vérification du clonage dans le vecteur de clonage (taille de l'insert, séquence...) et grâce à son promoteur (constitutif ou inductible) ce vecteur va diriger la bactérie hôte d'expression pour produire la protéine d'intérêt.  [...]

[Biologie Moléculaire] terminateur rrnb vecteur pMAL

Je viens de cloner mon gène dans un vecteur pMAL pour produire la protéine en système bactérien. Le gène est sous promoteur tac qui permet l'induction par l'iptg, mais du côté C-terminal après la séquence il y a deux régions terminatrices rrnB, que je n'avait jamais vu sur les vecteurs de type pET par exemple.  [...] Quel est l'interêt de ces séquences, pourquoi avoir choisi rrnB et pourquoi 2 régions terminatrices et non une seule.  [...]

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

Je vais cloner un gène dans un vecteur (pET21a et pGEX 4-T-2) et je vais ajouter des sites de restrictions dans mes primers avant de lancer la PCR. Quels procédures peut-on suivre pour faire introduire des sites de restrictions dans les séquences de nos oligonucléotides dans le but d'une expression dans Ecoli par exemple le sens de lecture du vecteur/lecture en phase, présence de ces enzymes dans polylinker, enzymes ne coupent notre gène.  [...] Si vous avez votre séquence ATG ATC ATC ATC ATC, vous allez supprimer l'ATG et faire entrer cela en Bam. Vous aurez donc dans votre vecteur. ATGxxBamHIATATATATATATA. Ce qui sera transcrit sera ATG xxG GAT CCA TCA TCA TCA TC. Ça ne codera pour la protéine que vous attendez parce que votre séquence codante n'est pas entrée en phase par rapport à l'ATG.  [...]

Transfection plasmide gateway et faible expression proteique

Je veux transfecter des Hek293T, j'ai essayer différents kit d'extraction du plasmide, vérifié la sequence du vecteur et de ma protéine, verifié la concentration d'ADN, testé plusieurs concentrations... je ne sais pas quoi faire d'autre.  [...] Oui séquence de la protéine est ok dans son intégralité... On essaye en ce moment de couper et lié le bout contenant la mutation... pas vraiment un bon taux de succès mais j'espère que ça marchera.  [...]