• Forum - Séquence, Plasmide, Amorces

Casse tête de PCR

J'ai réalisé un alignement entre la séquence du plasmide et les amorces (PromoterWise) il n'y a rien qui expliquerai des hybridations non spécifiques et encore moins c'est taille la d'amplicons.  [...] Voila ou j'en suis je précise que j'ai linéarisé mon plasmide sur gel et purifié la bande pour tenter de résoudre le problème sans résultat. J'ai aussi essayé une première fois avec des amorces simples (sans bras d'homologie 29pb) j'ai eu ces bandes non spécifiques mais également mon plasmide amplifié alors que l'emploi de Méga amorces (amorces simples + 50pb homologues a la séquence a insérer) n'a donné que de l'amplification non spécifique.  [...]

[biologie moléculaire] PCR à partir d'ADN génomique

Et bien non justement je ne sais pas si je peux faire confiance à mes amorces et je ne peux pas les tester sur la meme séquence clonée dans un plasmide parce que je ne l'ai pas et que le labo ou je me trouve n'est pas très bio mol à l'origine. Par contre j'ai repris les séquences d'amorces utilisées dans une publi donc normalement elles sont bonnes.  [...] ... Sinon j'ai essayé avec 50 et 100 ng et toujours rien... donc effectivement je doute de plus en plus de mes amorces... mais comment vérifier sans plasmide tout est là.  [...]

plasmide pDONR/Zeo

Savez-vous à quoi sert ce plasmide Les sites présents sont attP1 et 2 à quoi correspondant-ils M13 forward et reverse ainsi que le gène ccdB.  [...] Les flèches avec M13 désignent des régions sur lesquelles s'apparient des amorces qu'ils fournissent peut-être avec le kit et permet de vérifier que le gène est dans le plasmide (PCR, séquence).  [...]

[Biologie Moléculaire] [Manips Labo] Produire et purifier du ssDNA

Avec une paire d'amorces alors Sinon sur le plasmide ça élongue toute la longueur. Il me faut pour ma part elonguer que ma séquence de 300 nucléotides.  [...] Quand j'ai ecris ca il me semblait bien que qq chose clochait. Merci de m'avoir repris. Mon template etait un insert purifie a partir d'un plasmide methyle. J'amplifiais bien un ssDNA.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

oui c'est un peu court. Mais pour ce genre de technique tu dois utiliser des amorces contenant la séquence que tu veux modifier, mais aussi une séquence commune avec ta matrice d'ADN. Comme ca l'amorce s'hybride partiellement avec ton ADN, et le reste contient ta mutation.  [...] Dans un premier temps tu dois insérer ta séquence à modifier dans un plasmide. La Pfu turbo est une polymérase qui fait moins d'erreurs que la Taq. Par PCR, tes amorces contenant les mutations désirées vont être allongées, tu obtiendras ainsi des plasmides linéarisés, pareils au plasmide parental mais contenant tes mutations.  [...]

[Biologie Moléculaire] Séquençage d'un gène

Or, si on veut trouver la séquence d'un gène se trouvant dans un génome non séquencé, comment peut on connaître la séquence des amorces utiles.  [...] En fait ta réponse est un peu dans ta question ^^. On connaît la séquence des amorces car c'est le chercheur lui-même qui créer ses amorces qu'il va par la suite fixer à la séquence inconnue du gène.  [...]

Expériences en génétique…

Il existe de très nombreux plasmides différents et beaucoup ont été modifiés par génie génétique, car les plasmides sont utilisés comme vecteurs de clonage. On connaît donc la séquence de beaucoup de plasmides. Si tu connais la séquence d'un gène, c'est très facile de l'isoler, il suffit de faire une PCR avec des amorçes encadrant le gène et c'est finit.  [...] Comme on connait la séquence du plasmide, et donc la taille du fragment attendu, on peut le retirer du gel (par diverses techniques, si tu veux en savoir plus, je peux t'en expliquer une ou deux) et le recoller dans un autre plasmide à l'aide d'une enzyme appelée ligase ou le séquencer.  [...]

[Biologie Moléculaire] Design de sonde Taqman à partir d'une sonde FISH

Je voudrais savoir s'il est possible d'utiliser une sonde FISH (ciblant le 16S de bacteroides) comme sonde Taqman pour la quantification de la bactérie, si oui, comment on fait s'il vous plait Mon superviseur me demande d'utiliser la même séquence de la FISH (déjà publiée) pour la RT-PCR, mais aussi de designer des amorces de part et d'autre de cette séquence pour 1 PCR classique.  [...] mais uniquement pour designer les amorces vu que tu as ta séquence pour la sonde taqman. Ensuite, pour une PCR classique, tu reprends les amorces de ta qPCR et c'est parti.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Sinon ca vient peu être de tes amorces qui font des hairpines ou s'hybrident entre elles mais sans la séquence je peux pas de tire.  [...] Amplifie un fragment plus grand contenant cette séquence (si possible avec des amorces publiées), isole ton grand produit de PCR et fait une PCR nichées avec tes amorces d'intérêt dessus.  [...]

[Divers] Contenu "Matériels et méthodes" - rapport stage M1

Le gene xyz a ete amplifie a partir de l'ADN de la souche abc en utilisant les amorces A (3'sequence5') et B (3'sequence5'). Le produit PCR a ensuite ete purifie par le kit XXX (XXX, France) puis digere par les enzymes bamHI/EcoRI avant d'etre clone dans le plasmide xxx prealablement linearise par les memes enzymes.  [...] J'ai mis mes oligos dans un tableau avec les séquences et commentaires pour dire quel oligo apporte quoi dans l'histoire et j'ai fait un schéma où je les positionne sur les gènes. Le truc est que j'avais séparé mon M&M en 3. Souches bactériennes, plasmides, milieux de culture, Manipulation de l'ADN (tout ce qui est PCR), Construction des plasmides recombinants et je pensais ajouter une 4e partie Séquençage, mais là quand j'y pense, ça me paraît plus logique de le mettre dans Manipulation de l'ADN.  [...]