• Forum - Séquence, Mutation, Amorces

Utilité de la PCR en médecine ?

Je comprend maintenant que la PCR est avant tout un outil pour amplifier l'ADN. Cependant, il semble évident qu'il soit nécessaire de connaître la séquence de la mutation recherchée pour utiliser des amorces adaptées.  [...] Alors non, tu n'es pas obligé de connaître la séquence de la mutation que tu recherches, car tu peux choisir des amorces qui encadrent le locus de la mutation. Tu amplifies, tu séquences et tu regardes ensuite si la séquence est anormale, et si oui quelle est la nature de la mutation.  [...]

[Génétique] Diagnostic mutation autosomique récessive

l'ADN du patient est extrait à partir d'un prélèvement de sang veineux. La séquence du gène CFTR étant connue, il est possible de synthétiser deux amorces oligonucléotidiques de part et d'autre de la région de l'exon 10 où se trouve potentiellement la mutation F508del.  [...] Une réaction de PCR permet l'amplification de cette région, que celle-ci soit normale (absence de la mutation deltaF508) ou mutée (présence de la mutation). La distinction entre les trois génotypes possibles (N/N, F508del/N ou F508del/F508del) peut être obtenue par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et visualisation des produits de PCR aux U.V.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

Moi je désire muter la séquence GAATTC (EcoRI) en GGATCC (BamHI). Est-ce une mutation possible Si, oui qu'elles ont les amorces nécessaires, qu'elles seront leur longueur, leur pourcentage en G+C, de mésappariement et le Tm.  [...] Dans un premier temps tu dois insérer ta séquence à modifier dans un plasmide. La Pfu turbo est une polymérase qui fait moins d'erreurs que la Taq. Par PCR, tes amorces contenant les mutations désirées vont être allongées, tu obtiendras ainsi des plasmides linéarisés, pareils au plasmide parental mais contenant tes mutations.  [...]

[Biologie Moléculaire] Séquençage d'un gène

Or, si on veut trouver la séquence d'un gène se trouvant dans un génome non séquencé, comment peut on connaître la séquence des amorces utiles.  [...] En fait ta réponse est un peu dans ta question ^^. On connaît la séquence des amorces car c'est le chercheur lui-même qui créer ses amorces qu'il va par la suite fixer à la séquence inconnue du gène.  [...]

[Génétique] splicing+mutation

Ces 2 soeurs qui sont également malade posséde la même mutation mais hétérozygote ok super. Le problème et que je trouve pas l'effet qu'elle produit sur le cDNA, j'ai séquençé toute la région cDNA aprés la mutation et rien je ne trouve ni délétion ni retention intronique.  [...] L'ARN de ce patient me semble pas instable car on à comme même reussis à RT et amplifier assez facilement par contre j'ai pas amplifié le cDNA en entier (environ 5000pb)certaines parties du cDNA manque au séquençage (cause spécificité des amorces) mais ces parties sont du côté 5' de la mutation donc j'imagine mal un mauvais épissage avant cette mutation, mais bon il faut que j'optimise les primers pour tout amplifier pour être sure parceque parfois une mutation peut apparaitre comme par surprise aprés la transcription.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Ta température d'hybridation est faible, quel est le Tm de tes amorces Peux tu nous donner la séquence de tes amorces pour les checker.  [...] Franchement si ça déconne arrêtez de perdre du temps et faites synthétiser la séquence. Pour 1500pb il y en a pour 500¬, c'est vraiment rien. Et en plus vous pourrez vous amuser à mettre sites de restrictions, mutations, etc, ou vous voulez et à votre convenance.  [...]

PCR et vecteur de clonage

Mais tu dois de toute façon connaître un minimum la séquence que tu veux amplifier de manière à pouvoir élaborer tes primers (=amorçes qui vont encadrer la séquence à amplifier sur chacun des 2 brins). Dans le cas d'espèces peu connues génomiquement parlant, tu peux utiliser une sauce d'amorçes dégénérées qui va être un mélange de primers permettant une hybridation plus ou moins efficace avec ta séquence cible (c'est très simple à comprendre avec un shèmas.).  [...] Tu peux faire une PCR avec des amorces spécifiques d'une séquence pour en vérifier la présence dans un ADN donné. Par exemple à la suite d'un clonage, après sélection des transformants sur antibotiques/marqueur, avec des amorces spécifiques à l'insert, tu peux rechercher les transformants dont le vecteur a intégré l'insert d'intérêt.  [...]

soutern, PCR, banque genomique

En effet, la séquence inconnue est insérés au milieu d'une séquence connue, on peut donc y positionner les amorces et l'amplifier.  [...] Si tu parles d'amorces dégénérées (le tube contient plusieurs amorces, qui varie en une ou plusieurs positions), tu risques d'amplifier des séquences non spécifiquement. Je ne connais pas d'amorces absolument universelles (amplification de toutes les séquences d'ADN).  [...]

Casse tête de PCR

J'ai réalisé un alignement entre la séquence du plasmide et les amorces (PromoterWise) il n'y a rien qui expliquerai des hybridations non spécifiques et encore moins c'est taille la d'amplicons.  [...] Voila ou j'en suis je précise que j'ai linéarisé mon plasmide sur gel et purifié la bande pour tenter de résoudre le problème sans résultat. J'ai aussi essayé une première fois avec des amorces simples (sans bras d'homologie 29pb) j'ai eu ces bandes non spécifiques mais également mon plasmide amplifié alors que l'emploi de Méga amorces (amorces simples + 50pb homologues a la séquence a insérer) n'a donné que de l'amplification non spécifique.  [...]

applications de la PCR

Y'a plusieurs maniéres d'introduire une mutation. La 1ère consiste à la générer directement lorsque l'on design les primers (les amorces). C'est très utile.  [...] Note. la première méthode est ciblée car on sait à l'avance où se trouve la mutation (car on a générer les amorces à PCR soi-même), la 2ème est dirigéé mais l'on ne sait pas où se trouve la/les mutations, elle nécessite un screen fonctionnel.  [...]