• Forum - Séquence, ADN, Tag, Intérêt, Plasmide

[Biologie Moléculaire] cDNA et TAG quelle relation?

j'ai cherché sur la relation entre les séquences TAG et la cDNA, j' ai trouvé que la séquence TAG est une court séquence de cDNA qui est transcrit à partir de plasmide,  [...] et pour le plasmide pTTQ18 on dit que c'est un plasmide qui ne présente pas de cDNA,et pour ça on peut pas purifié le protéine recombinante qui en résulte par chromatographie d'affinité on utilisons le protéine de fusion issu de la traduction de la sequence TAG. est ce que c'est juste.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

J'ai moi aussi de la difficulté a trouver un vecteur approprié, Et Je ne comprend pas pourquoi le bon vecteur dans cet exemple serait PinPoint xa-1 Selon ce que j'ai vu il ne possede pas de sites de restriction communs avec la sequence d'ADNc dans sa region du gene de resistance Je ne comprend pas d'ailleurs pk le site de restriction doit se trouver dans la sequence de resistance a l'antibiotique et non ailleurs dans le plasmide.  [...] PinPoint contient un promoteur tac de transcription suivi de la séquence d'un tag-Xa. Le tag est un petit peptide qui permet de purifier la protéine indépendamment de la protéine d'intérêt, il est suivi de Xa qui est une protéine qui peut être clivée et permet de donc de retirer le tag après purification pour n'avoir plus que la protéine native.  [...]

Pourquoi utiliser le vecteur pH6EX3 pour faire du clonage moléculaire?

Dans une séance de laboratoire, on a utilisé le vecteur pH6EX3 pour y insérer un gène qui code pour la protéine BIP, pour transférer tout ça dans des bactéries E.coli. Je me demandais pourquoi on a utilisé ce verteur et pas un autre.   [...] peut être parce que ce plasmide permet de tagger l'insert avec un 6His. En fait cela permet de produire une protéine de fusion constituée de la séquence codée par l'insert et du tag 6xHis, tag qui peut être utilisé ensuite pour de la purification sur colonnes style NiNta, pratique pour avoir un peptide pur (ou presque).  [...]

[Immunologie] Fixation pour immonofluorescence

J'ai transfecté des cellules (culture primaire) avec des plasmides contenant mes gènes d'intérets taggés soit eGFP soit YFP. J'aimerai réaliser des immunomarquages mais j'ai des problèmes avec mes tags. En effet, lorsque je fixe mes cellules, les tags (qui sont solubles) ne sont plus visibles dans mes cellules transfectées avec les plasmides vides.  [...] Le plasmide vide signifie qu'il n'y a que la GFP. Donc la GFP est exprimée seule, pas en fusion avec la protéine d'intérêt. Cela fournit un contrôle indispensable pour montrer que les conditions utilisées n'affecte pas la localisation de la GFP, et donc prouver qu'une relocalisation éventuelle de la protéine de fusion GFP-X est spécifique de la protéine X.  [...]

[Biologie Moléculaire] insertion d'un tag HA au milieu d'une sequence.

J'ai un plasmide contenant la sequence codante d'un recepteur. Mon encadrant me demande de mettre un Tag HA au sein de cette sequence.  [...] D'autres equipes ont deja tague ce recepteur et je veux donc inserer mon HA au meme endroit de la sequence que ces equipes pour ne pas alterer la fonction de mon recepteur. Bien evidemment je ne peux pas cloner ce tag car il n'ya pas de site unique de restriction a cet endroit. Comment pourrais-je donc faire.  [...]

[Microbiologie] design des amorces sens et anti sens 5' 3' pcr

[Microbiologie] design des amorces sens et anti sens 5' 3' pcr.   [...] s'il vous plaît qui peut me donner les séquences d'amorces sens (forward) et anti sens (reverse) de la séquence d'ADN suivante 5'ATG GGC CGG GGG TAT ATC TCG GCA GCT AAT AAA TTT ATT TAT TCG GCC ATT CGC ATT AAA TTT CGG GCT GAA GAT TAG 3'.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de detection de ma protéine par immunofluorescence

voila j'ai transfecté mes cellules (HepaRG) avec un plasmide pcDNA3.1 Directional TOPO (Invitrogen) contenant mon insert d'intérêt (la protéase NS3 du virus de l'hépatite C). Ce plasmide contient aussi une tag V5, qui me permet (normalement ^^) de detecter ma protéine une fois exprimée dans mes cellules (grace à un anticorps anti-V5, Invitrogen).  [...] Avant de continuer inutilement mes manips avec mon vecteur je souhaiterai vérifier que mon protocole de marquage est correct mais je ne dispose d'aucun plasmide vide avec le tag V5...==. pas moyen de faire des controles.  [...]

[Biologie Moléculaire] purif des proteines recombinantes apres coupure au facteur X

la carte de mon plasmide est comme suit. une Chaperonne située en 5' (appelée Trigger factor. cela facilite le bon repliement de ma proteine d'interet et augmente d'une facon tres significative la solubilité de la proteine recombinante) suivi d'un His-tag puis du site de coupure du Facteur Xa et à la fin le Multiple cloning site.  [...] du coup si tu coupes avec le facteur X tu libères 2 fractions. La Chaperonne avec l'His tag (52 Kd) et la proteine d'interet (25 Kd).  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunodétection après production d'une protéine recombinante

Est ce possible comment peut il etre retenu de façon aussi importante A mon avis c est parce que le gene est apporté par un plasmide et donc en multicopie dans la bacterie, mais il n y a pas de raison qu il soit retenu lors de la purif.  [...] Tous les binome n ont pas utilisé les mm vecteurs et systemes d expression, mais certains ayant aussi utilisé un systeme comportant le plasmide pLysS (contenant l adn codant pour le lysozyme) detectent aussi une bande intense correspondant au lysozyme...bref, le soucis c est que je n arrive pas a l expliquer.-s.  [...]

Les codons stops

Je me demande s'il vous plait, quels sont les codons ou les séquences qui peuvent arrêter la transcription de l'ADN lorsque l'ARN polymérase transcrit le gène ADN. est-ce que c'est les codons comme TAG.  [...] L'autre fait intervenir une hélicase spéciale appelée facteur rho. Cette protéine migre le long de l'ARN en cours de polymérisation, rattrape l'ARN polymérase et le détache de l'ADN. Je n'en sais pas plus sur ce mécanisme.  [...]