• Forum - Saturation, Membrane, BSA, Lait

[Biochimie] Western blot

L'incubation de la membrane de nitrocellulose avec le methanol est important avant le transfert même si aujourd'hui on à des membranes d'assez bonnes qualité.  [...] Tampon de saturation. attention, ne JAMAIS utiliser de lait pour saturer des membranes qui seront incubées avec des anticorps anti-phosphotyrosine. Le lait contient des phosphatases, alors tu vas perdre ton signal. Sinon, comme le dit Yoyo, il n'y a pas de protocole idéal.  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique du Western Blot

C'est pour ca que pour bloquer la membrane on utilise une solution très riche en protéine (BSA, ou tout simplement du lait dilué dans ton tampon de marquage).  [...] Le blocage des sites de fixation non spécifique des anticorps aux protéines que tu as transféré sur la membrane peut aussi se faire si nécessaire mais c'est différent.  [...]

[Biochimie] bruit de fond western blot

Tu as essayé de toucher à la saturation BSA versus lait par exemple. Une étape de saturation entre le primaire et le secondaire peut aussi éliminer du non spé.  [...] Je sais que nous on réutilise le méthanol dans lequel on a trempé la membrane car apparemment on a pas le choix d'utiliser du méthanol par contre pour le tampon de transfert, on peut utiliser de l'éthanol à la place du méthanol.  [...]

[Biochimie] tween20 et western-blot

Je voulais savoir à quoi sert exactement le tween20 dans le western Je sais que c'est un detergent donc je vois bien l'utilité pendant les phases de lavage pour minimiser les interactions non spécifiques mais en fonction des protocoles il y en a aussi en général dans la phase de saturation de la membrane (avec la BSA ou la caséine).  [...] .. quelle est alors son utilité Que recommanderiez-vous faut-il en mettre pendant la saturation et si oui pourquoi.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expliquer le Blocking buffer

en immunohisto, je ne sais pas. Par contre, en western blot, on utilise un blocking buffer pour saturer la membrane. Ce buffer est souvent du lait ou de la BSA ou une sauce commerciale... Le principe est qu'il contient des protéines. Les anticorps étant eux même des protéines, ils pourraient se fixer non spécifiquement sur la membrane et faire du bruit de fond lors de la révélation.  [...] En saturant la membrane avec des protéines non spécifiques, il y a moins d'AC qui va s'y fixer car les interactions protéine/membrane non spécifiques doivent être plus fréquentes que les interactions protéine/protéine non spécifiques.  [...]

[Immunologie] Problème ELISA direct avec les puits non coatés

Est ce que le lait serait adapté pour la saturation d'une plaque coatée avec un peptide (23 acides aminés) Si oui, à quelle concentration saturez-vous en générale avec le lait.  [...] Quelle concentration de lait et tampon as tu finalement sélectionné pour bloquer tes puits Combien de temps et à quelle température fais tu la saturation As tu ajouté du lait aussi dans ton tampon de dilution des sérums.  [...]

Saturation BSA pour purif de protéine His-tagged

Donc je me demande si on ne pourrai pas enlever ce bruit de fond (qui ne doit pas partir totalement car les protéines sont surexprimées mais qui doit quand même fortement diminuer) en saturant la résine avec 1% BSA avant l'incubation avec les échantillons.  [...] Durant mon mémoire, j'ai du faire beaucoup de mise au point de mes WB, un des anticorps primaire donnait des bruits de fond terrible, Je suis arrivée à des résultats incroyable en enlevant la BSA d'un part et en la remplacant dans les différentes solution le lait gloria par le lait amersham.  [...]

Problème de traduction publication.

Microbial cDNAs are then selectively captured by hybridization to biotinylated microbial genomic DNA that has been prehybridized with blocking microbial ribosomal DNA (rDNA) fragments.   [...] On parle ici d'ARNr bloquants car, comme dans toute hybridation (ELISA, Western, Southern...) on previent toute liaison non specifique en saturant les sites de fixation aspecifiques avec des generiques (proteines de lait ou BSA pour ELISA et Western, ARNr ici).  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins - Page 2

Mon 2e problem. Jai strippé mes membranes après la 1ere revelation. Apres blocage de la membrane, jai incubé les ACs 1aire, 2aire etc. Mais à la revelation, plus rien. LES Memes ACs qui avaient marché à la premiere revelation ne donnent plus rien. J'ai un film vierge.  [...] Pour pAkt, il faut essayer différentes conditions de blocage, notamment BSA et lait, et aussi changer le milieu d'incubation de l'anticorps (lait ou BSA également).  [...]

[Biologie Cellulaire] Qui à déjà utilisé le système SNAP i.d. de Millipore pour ses Western Blot?

Une representante de millipore m'a présenté le système SNAP i.d. qui me permettrait de faire le blocage de la membrane, l'incubation avec l'anticorps primaire, les lavages et l'incubation avec l'anticorps secondaires de mes WB en une demi heure... Ce qui est très interessant etant donné que ça me ferait gagner une journée à chaque WB.  [...] En fait apparement c'est un systéme qui optimise le contact entre l'anticorps et la proteine, en faisant passer la solution d'AC à travers la membrane.  [...]