• Forum - Révélation, Membrane, Anticorps

Sds-page

Donc d'après vous, lors de ma révélation sur membrane avec des anticorps, mes anticorps reconnaissent mes protéines dans leur configuration d'origine (structure III) Je pensais qu'elles restaient sous conformation I.  [...] Oui je sais, on peut aussi utiliser du DTT qui est non hépatotoxique et inodore pour les dénaturer. Mais je me demande pourquoi on utilise du SDS dans le tampon ET dans les gels. Ne pourions nous pas mettre du SDS en plus forte concentration dans le tampon et attribuer la charge du gel de concentration et du gel de migration simplement avec des solutions de Lower buffer et Upper buffer sans SDS (Trizma base + Acide chlorhydrique pour ajuster le pH souhaité).   [...]

les gels de compression et de sépartion

Les gels sont utilisés pour l'électrophorèse, le wester blot intervient après lors du transfert du produit du gel sur une membrane et révélation par anticorps ou réactions enzymatique. Ne confondez pas les deux.  [...] La différence de pH permet une vitesse de migration différente, une migration plus lente permet l'entrée dans le gel et la concentration des protéines. L'effet est lié au pI de la glycine du tampon de migration.   [...]

[Biologie Moléculaire] Expliquer le Blocking buffer

en immunohisto, je ne sais pas. Par contre, en western blot, on utilise un blocking buffer pour saturer la membrane. Ce buffer est souvent du lait ou de la BSA ou une sauce commerciale... Le principe est qu'il contient des protéines. Les anticorps étant eux même des protéines, ils pourraient se fixer non spécifiquement sur la membrane et faire du bruit de fond lors de la révélation.  [...] En saturant la membrane avec des protéines non spécifiques, il y a moins d'AC qui va s'y fixer car les interactions protéine/membrane non spécifiques doivent être plus fréquentes que les interactions protéine/protéine non spécifiques.  [...]

Immunoblot

Et en effet l'utilisation d'un anticorps secondaire reconnaissant l'anticorps primaire est désormais utilisé la plupart du temps (pour ne pas dire tout le temps ), mais là encore j'ai voulu simplifier pour que ce soit compréhensible, en introduisant en même temps la notion de détection par anticorps couplé à une activité physique, chimique ou biochimique détectable.  [...] Le western blot consiste en une migration des protéines dénaturées au beta mercaptoethanol et SDS dans un gel de polyacrylamide+SDS (détergent qui va dénaturer les protéines et les charger), un transfert sur membrane et une révélation grâce à des anticorps marqués.  [...]

[Microbiologie] western blotting

j'ai fait migrer mes protéines par sds page en puits confondus, sur le gel les bandes sont nettes, en faisant le transfert sur membrane de nitrocellulose et après révélation par le 4 chloro1 naphtol je n'ai pas obtenu des bandes pourquoi à votre avis sachant que le transfert s'est bien passé j'ai dilué les anticorps primaires 1/100 et les anticorps secondaires 1/2000 je doute par rapport au titre des anticorps que j'ai utilisé sachant qu'ils proviennent des patients atteints de Mycoplasma pneumoniae qu'est ce que je dois faire.  [...] Ensuite, si vous n'avez aucune idée du titre des anticorps, et de leur qualité, il va être difficile de faire autre chose que d'essayer d'autres dilutions. Les anticorps perox ne sont pas très stables (c'est l'enzyme qui se dégrade), vous pourriez utiliser un autre lot, neuf, ou tester ce secondaire avec un anticorps primaire dont vous être certain(e).  [...]

[Biochimie] migration sds page

Après la migration, je fais un transfert et je vérifie ensuite par du rouge ponceau la qualité de la migration et du transfert. Ensuite je fais une marquage anticorps. Le problème est donc que je ne fais pas de photo au ponceau, je le rince direct et je sature ma membrane pour la révélation.  [...] Je commence par vérifier la qualité du transfert par une coloration rouge ponceau, et c'est là que je me rends compte de la qualité de la migration de mes protéines. Après le rouge ponceau je rince la membrane dans du PBS et je fais une immunorévélation de ma (mes) protéines d'intérêts.  [...]

[Biochimie] Western blot sur Fractions polysomales

J'ai utilisé différentes méthodes. une extraction au méthanol mais ma révélation d'anticorps n'est vraiment pas jolie du tout, j'ai essayé une extraction au phénol/chlo,même résultat. Je suis passé à une extraction au TCA avec lavage à l'acétone et ici, ma membrane est moins sale, mais mes bandes ne sont pas encore satisfaisantes.  [...] Personnellement, j'utilise le TCA sur les fractions de ribosome de levure et ca marche tres bien. Ca permet de concentrer les échantillons et d'en déposer une bonne quantité sur le gel pour la révélation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème révélation WB

(On m'avait dit que cela pourrait venir d'un problème de contamination de boite dans laquelle la membrane a incubée... mais je n'ai pas d'explication vraiment valable ).  [...] Je trouve assez bizarre que l'actine soit si peu intense en WB...Es-tu sûr de regarder la bonne taille L'anticorps primaire est validé Je n'approuve pas trop la découpe multiple d'une membrane pour faire plusieurs révélation dessus. Si vous faites une grosse découverte (pourquoi pas) qui sera publiée dans un grand journal, on peut vous demander les WB entiers.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins - Page 2

Mon 2e problem. Jai strippé mes membranes après la 1ere revelation. Apres blocage de la membrane, jai incubé les ACs 1aire, 2aire etc. Mais à la revelation, plus rien. LES Memes ACs qui avaient marché à la premiere revelation ne donnent plus rien. J'ai un film vierge.  [...] Pour pAkt, il faut essayer différentes conditions de blocage, notamment BSA et lait, et aussi changer le milieu d'incubation de l'anticorps (lait ou BSA également).  [...]

[Immunologie] protocole immuno-histo-chimique

c'est la révélation. ton anticorps secondaire est couplé a une peroxydase, qui transforme le DAB en un produit coloré, donc localisé la ou Ki67 se trouve (d'ou l'intéret d'inactiver les perox. qui trainent un peu partout).  [...] Pour les peroxydases endogènes, ce sont les peroxydases qui sont présentent dans ton tissu avant que tu n'ajoutes ton anticorps couplé à la peroxydase. Ces peroxydases endogènes utiliseraient la DAB exactement comme ton système de révelation et génereraient du bruit de fond.  [...]