• Forum - Restriction, Plasmide, Digestion

calcul dilution plasmide

dans le protocole que j ai en nous demande de prendre 5ug du plasmide la concentration de mon plasmide quand je l ai verifier au nanodrop est de 43ng/ul.  [...] ou carrément reconcentre mon plasmide car sa donne 116ul et le volume final dans le protocole doit etre de 100ul donc c impossible.  [...]

[Biologie Moléculaire] Carte de restriction électrophorèse

J'ai réalisée une digestion d'un plasmide bactérien inconnu afin de déterminer sa carte de restriction. Pour cela, je l'ai digéré avec des enzymes de restriction. BamHI et EcoRI. J'ai fait une digestion avec chacune des enzymes tampon E pour BamHI et tampon MC pour EcoRI et une avec les 2 dans le tampon MC (activité 75% pour bamhI et 100 pour ecorI).  [...] En supposant que dans la double digestion mes 2 enzymes aient coupé au même endroit, je pense pouvoir multiplier 3090 par 2 soit 6180 pb pour la double digestion ce qui serait cohérent avec les autres résultats. Mais je ne comprends toujours par le résultat de cette double digestion, car selon moi j'aurais du obtenir les mêmes résultats que la digestion EcoRI sinon je ne peux pas trouver la carte de restriction de mon plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction sur plasmides- Digestion complète et incomplète

dites moi svp comment peut on trouver le nombre de fragments d'ADN produits lors d'une double digestion du plasmide pCR-gai par les enzymes de restriction HindIII et EcoRI et leurs tailles respectives.  [...] sachant que pCR-gai est un plasmide d'environ 5500 pb qui contient la séquence codante du gene GAI (1579 pb), et le nombre de sites de restriction de HindIII est 2 et EcoRI est 2 par molécule.  [...]

PCR, template et riz anti-alzheimer

3) les sites de restriction permettent en effet que les extrémités de tes morceaux soient cohésives. Donc on peut extraire un fragment entre certains sites, et si on choisit bien son plasmide receveur, l'insérer de facon orientée.  [...] 4) Je n'ai pas le temps de lire le papier, mais en général le plasmide contient un promoteur qui permet une expression plus ou moins forte de ce qui se trouve derrière. Ca dépend du tissu cible, de si on veut une expression constitutive ou inductible, etc.  [...]

isolation d'un plasmide

S'assurer que la bactérie ne possède pas de plasmide avant la transformation Et bien en principe, elles ne possèdent pas le plasmide d'intéret (logique). Tout autre plasmide nous est indifférent. Ce que l'on fait en pratique, c'est que l'on verifie après coup que les bactéries que l'on a selectionnées portent bien l'insert d'intéret (digestion de restriction, séquencage).  [...] Tu peux aussi vérifier la présence du plasmide par insertion d'un gene de résistance à un antibiotique (plus rapide que de faire des digestions ou séquençage) quand c'est possible.  [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

Je suis désolée mais je comprends pas ce que je dois faire... J'ai bien compris que si on coupe un plasmide circulaire via une enzyme de restriction il devient linéaire mais les extrémités c'est quoi.  [...] Tu digères un plasmide lorsque tu veux modifier ce dernier, y rajouter un fragment ou en retirer un. On passe avant tout par cette étape de digestion. Après tu as un étape de ligation si éventuellement tu veux recirculariser le plasmide après y avoir insérer un fragment entre XhoI et NcoI.  [...]

interpretation electrophorese d'un plasmide purifié

Il va falloir plus de détails, quand tu dis purifié y a t-il eu digestion par enzyme de restriction après Parce que ça ne m'a pas l'air d'être du plasmide circulaire tout ça. De plus il y a plusieurs puits pour la même chose.  [...] Bonjour et bien non y'a pas eu digestion par des enzymes en fait on just purifier et on a fait une electrophorese. on a plusieurs puits parcequ'on etait nombreux et chacun a deposer son plasmide purifie.Merci.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

J'avais eu le même probléme l'année derniére, en plus moi je faisais des litres de culture, je ne te raconte pas la galére. Pour moi c'était. BL21 Star(DE3), plasmide pGEX-2T avec fusion GST-toxine bactérienne, promoteur tac et induction á l'IPTG. Finalement la solution dans mon cas pour avoir une assez bonne quantité de protéines recombinantes, était d'induire á une DO tardive de 1.  [...] Persso la première chose que je ferais c'est transfo, selection, culture overnight et miniprep de plasmide. Après digestion par restriction et tu sort la GST ou ton insert. Et là t'es sur que la construction est bonne déjà ça me semble essentielle.  [...]

[Biologie Moléculaire] electrophorèse en gel d'agarose

Merci pour votre réponse. (je connais mon cours et ca fait longtemps que je cherchais la réponse à ma question). ce que je ne comprenais pas c'est que dans mon énoncé on me parle d'un plasmide et non d'une cellule. on a digéré le plasmide pBR322 par différentes enzymes de restriction.  [...] mais dans ce cas, si je fais agir une enzyme de restriction qui n'a qu'un site de restriction sur le plasmide il faut que la digestion soit complète pour que je n'obtienne que des fragements de même taille et même volume.  [...]

[Biologie Moléculaire] plasmide recombinant et ADN ligase

j'ai un TP de digestion enzymatique et je suis bloquée sur une question concernant la circularisation d'un fragment d'un plasmide (ce dernier a été hydrolysé par l'enzyme de restriction Agel,ensuite incubé avec la klénow en présence de 4 dNTP, ensuite digéré par EcoRV puis son plus grand fragment contenant 2 sites BglII est purifié).  [...] ma question est. avec quel enzyme peut-on favoriser la circularisation et dans quelle condition Je suppose quu'on utilise l'ADN ligase mais dans quelle condition j'en ai aucune idée.   [...]