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Calcul de ratios en real time RTqPCR: Combinaison de gènes de référence.

J'étudie le niveau d'expression d'un gène A, j'ai à ma disposition 40 échantillons (d'ARN total issu d'extraction). Je ne peux passer que 10 échantillons par série sur les machines de RT qPCR. Je dois donc les passer en 4 fois. Pour homogénéiser les differentes séries, je dispose d'un échantillon calibrateur que j'utilise à chaque série de RTqPCR.  [...] Pour le calcul du Ratio de mon gène A par rapport au gène de ménage sur un échantillon, et normalisé par rapport à mon calibrateur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Résultats PCR quantitative

Je cherche à montrer la modification de l'expression de gènes dans une lignée cellulaire au cours du temps et des différents stimulus (traitements). Mon échantillon contrôle étant la lignée sans traitement au T 24h post-ensemencement.  [...] On procède comme pour les Ct. il faut normaliser les concentrations par rapport à un gène de ménage, ensuite on peut exprimer les différence d'expression entre les différentes conditions comme un ratio.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR quantitative

2. D'où 2ème problème. il peut arriver que l'efficacité de la PCR soit différente entre la PCR sur la gamme standard et la PCR sur l'échantillon. Notamment si les conditions/méthodes d'extraction d'ADN sont différentes, tu peux avoir des contaminants différents qui vont influer différement sur l'efficacité de PCR, et donc l'utilisation de la gamme standard sera un peu faussée.  [...] Une solution Utiliser ton échantillon pour faire une gamme standard pour vérifier l'efficacité d'amplification, mais dans ce cas tu n'auras bien évidement pas de quantification absolue, tu ne pourras faire que du relatif par rapport à un gène de ménage, sans compter l'augmentation des coûts due au fait que théoriquement il faudrait faire une gamme pour chaque échantillon.  [...]

[Biologie Moléculaire] qRT-PCR, quel programme d'analyse?

Perso je bosse avec une gamme de dilution de mes ADNc (1/10 à 1/640). Ca me permet d'avoir la concentration (relative) de mes échantillons (en tripliqués c'est mieux). Ensuite je normalise tout ça par rapport à un (ou +) gène de ménage.  [...] Pour les concentrations relatives, le logiciel de ton cycler (light cycler, realplex...) doit faire l'affaire. J'utilise de préférence une méthode de calcul automatique pour déterminer le seuil (Ct). Pour la normalisation, un simple ratio des concentrations relatives (gène d'intérêt)/(gène de ménage) sur excel suffit. Reste à faire les tests statistiques.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr quantitative eficacité de la pcr

Pour améliorer l'efficacité, il faut jouer sur la pureté et la quantité de tes ADN (car on amplifie des ADNc, pas les ARN en quantitatif), les temps et température des différentes étapes, la concentration en MgCl2 et en amorces.  [...] L'efficacité est assez rarement égale à 100%. Des tas de paramètres influent sur celui ci avec des relations complexes. Si tu connais ton efficacité, tu peux savoir combien d'ADNc on donné par la suite les amplicons, donc non ça me parait pas illogique. C'est le but de calculer cette efficacité, car pour ce qui est de la limite inférieure pour accepter la manip, c'est un peu flou.   [...]

[Biologie Moléculaire] Quantification relative en qPCR

Je mène en ce moment des expériences de qPCR visant à quantifier l'expression de quelques gènes par rapport à un gène de ménage suite à une transfection.  [...] Pour la représentation, c'est comme vous le sentez en fait, je ne crois pas qu'il y ai de normes. Mais c'est vrai que le plus parlant reste un histogramme avec des barres d'erreurs. Faire de ce ratio un pourcentage me parait une bonne chose également, c'est généralement plus simple à dire ce gène est sous exprimé d'environ 20% dans la condition A que de parler d'un ratio de 0,8.  [...]

[Immunologie] Normalisation de données issues d'un séquençage NGS (ARN)

Le principe de la normalisation des données, c'est qu'au cours du processus d'extraction, purification, RT, etc, tu peux perdre une fraction significative de tes ARNs. Du coup, d'un échantillon à l'autre, les quantités d'ARNs varient totalement. Mais les rapports de concentrations entre gènes (au sein d'un réplicat), ou de gènes de ménages au sein de ton expérience, ne changent pas.  [...] Ce que ces algorithmes effectuent, c'est rechercher un groupe de gènes, dits gènes de ménage dont les rapports de concentration sont les mêmes au sein des réplicats et également entre les échantillons. Une fois ceci fait, toutes les concentrations des autres ARNS sont normalisées par ces gènes de ménage, ce qui permettra d'identifier des changements.  [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

L'idéal est de confirmer que tu as bien pris la même quantité d'ARN en quantifiiant aussi un gène de ménage (qui ne varie pas en fonction du traitement ou de la pathologie), et ce gène de ménage doit être au meme niveau dans tes 2 echantillons. Si ce n'est pas le cas, c'est que tu as.  [...] En theorie, si ton (tes) gene(s) de menage est solide, tu n'as meme pas a quantifier l'ARN au depart puisque ton gene de menage va te normaliser tes resultats entre tes differents echantillons. En plus, c'est nettement plus precis qu'une quantification par la DO280 qui va quantifier a 95% des ARN stables et non pas des messagers.  [...]

Housekeeping gene (gene de ménage)

Oui mais est ce que justement on pourrait faire une normalisation, en se disant qu'une certaine quantité d'ADN génomoque correspondrait à une quantité de cellules donnée dans chaque échantillon.  [...] Ce que j'ai envie de faire c'est de d'amplifier un gène de ménage (spécifique à l'Homme) dans un volume d'échantillon de sang donné puis amplifier le même gène dans le même volume d'échantillon de selle, puis faire une normalisation par dilution des quantités d'ADN. Qu'en pensez vous.  [...]

Gène de ménage (gène de référence...)

Lorsque tu auras compris le Ct tu verras que le delta Ct est logique. C'est la différence entre le Ct du gène que tu veux analyser et le Ct du gène rapporteur ou gène de ménage. Ainsi tu peux avoir une valeur relative d'expression de ton gène d'intérêt. En fait ton gène de ménage sert à normaliser tes valeurs pour pouvoir comparer différents échantillons.  [...] Ce que tu vas donc faire c'est faire une qPCR pour quantifier le TGFB et un gène de ménage (ex. GAPDH) dans chaque échantillon. Ensuite tu vas faire le delta CT entre la Ct du TGFB et celle de la GAPDH. Etant donné que tu as la même quantité totale d'ARN dans tes échantillons la Ct de la GAPDH ne devrait pas beaucoup changer (puisque c'est ton gène de référence) par contre celle du TGFB oui.  [...]