• Forum - Rapporteur, Activité, Construction

[Biologie Moléculaire] "Apparition" d'une séquence de fin d'épissage

En fait, il s'agit de nous faire étudier la régulation de l'expression d'un gène en réalisant plusieurs constructions de type séquence non codantes du gène d'intérêt+gène rapporteur sans ses UTR, et en faisant varier les zones déletées d'une construction à l'autre.  [...] Mais au préalable, il faut s'assurer que dans toutes les constructions, on obtient une protéine rapporteuse fonctionnelle, ce qui peut ne pas être le cas si on a modification de l'epissage à cause de la délétion.  [...]

Stratégies d'insertion de fusions de gènes

2. Inconvénient. on ne sait pas où la contruction s'intègre, elle peut donc être insérée au coeur d'une séquence essentielle à la régulation du gène d'intérêt et donc l'activité du gène rapporteur peut ne plus refléter strictement le niveau d'expression du gène d'intérêt.  [...] Ben en fait, je parlais de disrupter la copie endogène du gène d'intérêt, pour que les facteurs de régulation ciblent notre construction et uniquement celle-ci (genre. pas de compétition)... Ou bien la copie endogène du gène rapporteur afin d'être sûre que l'activité observée soit bien dûe à notre construction et pas à une activité native (ça c'est déjà un peu plus logique, non bien qu'il soit bien sûr plus simple d'utiliser une souche déjà mutée sur le gène rapporteur...).  [...]

[Biologie Cellulaire] gal4

Vous avez des systèmes double hybride avec une complémentation gal4-VP16 pour trouver des protéines interagissantes entre elles. Vous avez aussi des tests en culture cellulaire avec des fusions Gal4-protX sur constructions 17m-rapporteur. Elles permettent de tester l'activité activatrice ou répressive sur la transcription.  [...] il y a aussi tout simplement toute une série de plasmide d'expression posssedant le promoteur GAL4, qui permet d'induire l'expression du gene cloné qu'en absence de glucose (en presence de galactose par expl).   [...]

[Biologie Moléculaire] Comment pRb peut-elle augmenter l'activité d'un promoteur ?

Grâce à une méthode de marquage d'un seul des 2 brins d'ADN suivie d'une digestion avec une très faible quantité de DNase d'ADN incubé avec C/EBP5 seul ou C/EBP5+Rb on conclut que c'est 2 facteurs se fixent sur un même module.GC.   [...] De plus, grâce à un système rapporteur Luciférase, on mesure l'activité d'un promoteur Y qui ne contient pas de module E2F et DP. Cette activité est mesurée seul, en présence de facteur C/EBP5, et en présence de C/EBP5+Rb. Les résultats montrent que l'activité Luciférase est nettement supérieure en présence de Rb.  [...]

[Biologie végétale] Différence entre GUS et RT-PCR

Dans le cas du gène rapporteur GUS, tu as localisation de l'expression à un endroit précis in situ. Autrement dit, je souhaite savoir où et quand s'exprime le gène tartampion, je fais donc une construction fusion entre le gène GUS et le promoteur du gène d'intérêt et je suis l'apparition de la coloration bleue.  [...] Ce qui est important là c'est que le gène GUS code comme tu l'as précisé pour une enzyme donc je pourrai suivre l'évolution de l'activité enzymatique au cours du temps. cela me donnera une cinétique via laquelle je pourrai déterminer la cinétique d'expression du gène d'intérêt.  [...]

[Biologie Moléculaire] organisation plasmide

Il peut arriver que tu doive sélectionner le promoteur pour une construction particulière, dans ce cas là c'est faisable mais plus compliqué car les séquences promotrices sont très variables, souvent situées à une distance pouvant aller jusqu'à 4000 pb pour les plus complexes.  [...] Non il ne faut pas aller chercher trop loin. Si c'est un plasmide RAPPORTEUR, on veut mesurer l'ACTIVITE d'un PROMOTEUR en mesurant indirectement l'expression d'un gène quantifiable comme ß-galactosidase. Dans ce cas la, on a besoin DU PROMOTEUR d'intérêt et c'est lui que l'on clone dans le MCS en AMONT du gène rapporteur.  [...]

hybridation in situ vs rapporteur

Mais a mon avis, le principal avantage de l'in situ est que l'on detecte directement l'ARN present a un moment donne alors qu'avec le gene rapporteur, on s'eloigne un peu de la situation normale puisque l'on a du introduire une construction dans l'organisme (il y a eu des problemes, cf Taylor C.B. (1997) Promoter fusion analysis. an.  [...] Ca depend comment est realisee la fusion, il est possible de faire une fusion traductionnelle du gene rapporteur avec la proteine d'interet afin de detecter la localisation de celle ci. Dans ce cas, il est recommande de transformer une telle construction dans un mutant pour le gene d'interet afin de voir si la proteine de fuision complemente le phenotype (un tres bon controle).  [...]

[Biochimie] principe du gene rapporteur, sonde

on prend un gene dont on ne connait pas l'expression, on le combine avec un gene qu'on connait (ex.luciferase), on l'introduit dans la cellule (avec un virus par ex) et on regarde la quantité de lumière produite, celle ci étant proportionnelle à l'activité de la luciférase et donc du gene inconnu.  [...] La quantité d'oxyluciférine produite est proportionnelle à l'activité de la luciférase donc à l'activité du promoteur du gène rapporteur ainsi que du gène dont l'on cherche à mesurer l'expression.  [...]

[Génétique] Elément régulateur du promoteur d'un géne

Bonjour' J'ai un souci comment sait on à quelle distance se trouve l'enhancer qui active le promoteur d'un gène connu.Peut on connaître la séquence ADN correspondante à ce enhancer Merci de me renseigner Impossible de le trouver Juju.  [...] Tu effectues des deletions sequencielles de la region 5' au promoteur des que tu perds l'activite promoter (identifie par un gene rapporteur tel que lacZ ou luc) c'est que tu as touche une region importante pour la stimulation du promoteur. (Ca permet aussi de trouve les eventuels represseurs aussi puisque si tu deletes le represseur alors le promoter deviens superactif).  [...]

[Biologie Moléculaire] activation de la voie NOCTH par sDLL4

[Biologie Moléculaire] activation de la voie NOCTH par sDLL4.  [...] Je voudrais savoir si quelqu'un a déjà utilisé sDLL4 de sigma (ou d'un autre firme), pour activer la voie NOTCH dans des cellules HEK 293 quelles sont les conditions de culture. je peux ajouter DLL4 à quelle concentration si j'ai déjà transfecté les cellules avec un rapporteur luciferase, combien de temps est nécessaire pour que DLL4 active le clivage de NOTCH1 intracellulaire (à la fin j'aimerai mesurer l'activité luciferase et faire un western anti-NICD peut-être).  [...]