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[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot chez E.COLI

Normalisation de la quantité de protéine Western Blot chez E.COLI.  [...] je voudrai connaitre quelles sont les protéines chez E.coli qu'on utilise pour pouvoir normaliser une protéine d'intérêt (comme l'actine chez les eucaryotes).  [...]

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot

Pourriez m'expliquer comment on fait pour normaliser une quantité de protéines lorsqu'on réalise un western blot, je sais qu'il faut utiliser des protéines comme la béta tubuline mais techniquement on fait comment.  [...] Même si le western n'est pas une méthode quantitative il est aussi possible de mesurer l'intensité de tes bandes avec un logiciel, et de normaliser ta prot d'interêt par rapport à ta protéine contrôle mais en général on se contente du visuel.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pull down GST

Si ta production n'est pas très grande, attention toutefois à la quantité de billes nécessaire, car plus il y a de billes, plus tu augmentes la possibilité d'intéractions aspécifiques avec les billes. Ta protéine est elle soluble Car il se peut aussi qu'elle soit produite en grande quantité, mais non solubilisée dans le tampon d'extraction.  [...] La quantité nécessaire dépend de plein de paramètres, dont le poids moléculaire de la protéine d'intérêt (plus son PM est petit, moins il y a en besoin, car plus il y a de mole/µg), la force d'intéraction avec le partenaire, du type de détection (western blot, autoradiographie).  [...]

[Biologie Moléculaire] Taux d'expression de gènes et fonction des protéines...

Suite à une expérience incluant un traitement A et un traitement B sur des animaux, je travaille sur l'expression de gènes qui codent pour des protéines dont la fonction est connue. Je trouve des différences significatives entre les taux d'expression de gènes des individus ayant subi le traitement A et ceux ayant subi le traitement B.  [...] Parce que quantité d'ARN =/= quantité de protéine exprimée. Si c'est par western et que tu as donc bien plus de protéine dans un cas que dans l'autre, l'explication peut éventuellement venir d'un manque de substrat pour la synthèse de la coquille.  [...]

[Génétique] Western blot

Je suis actuellement étudiante en Master 1 de génétique et je fais mon stage dans un labo de génétique et je fais beaucoup de Western Blot sur des lysats issus de lignées de liposarcomes. A chaque révélation des bandes, je constate que les bandes du contrôle que je met (la tubuline) ne sont pas identiques d'un puit à l'autre ce qui suggère que je n'ai pas déposé la même quantité de protéine dans chaque puit, mais pourtant je fais bien attention de bien déposer la même quantité de 20µl par puit (30µg de prot pour un QSP de 40µl avec du tampon de laemmli et du tampon de charge.  [...] en fait il est très souvent difficile de réaliser exactement le même dépôt, d'où ces variations. De plus, suivant la méthode utilisée pour doser la concentration en protéine on est +/- précis. C'est pourquoi normalement pour toute quantification on utilise un rapporteur interne qui normalement ne varie pas dans les conditions testées (souvent l'actine ou la tubuline) et on rapporte le signal obtenu pour notre échantillon au signal obtenu pour le rapporteur (une division quoi ^^).  [...]

Problème RT-PCR sur cDNA

Une autre possibilité. un Western Blot avec un anticorps specifique du peptide que donnerait cet intron s'il était traduit. Si le Western est positif alors tu auras prouvé que cet intron est inclus et tu pourrais même estimer la quantité avec un anticorps contrôle spécifique d'une autre partie de ta protéine.  [...] Si tu retrouves toujours les mêmes cicatrices (=intron mal épissé), c'est bien de l'épissage alternatif, avec des sites donneurs et/ou accepteurs alternatifs qui enlèvent une partie de l'intron habituel. Il y a des logiciels qui prédisent la force des sites d'épissage selon le contexte des base comme NetGene2 http.//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/.   [...]

[Biologie Cellulaire] Southern Blot, Northern Blot et Western Blot

Le but est bien de vérifier la présence d'une protéine (dans le cas du western blot) et de la quantifier (pour être exact ce n'est pas une quantification absolue mais c'est une mesure qui va permettre de comparer la quantité de la dite protéine entre deux conditions expérimentales.  [...] Petit exemple concret. admettons que tu travailles sur la maladie de Steinert, c'est une maladie musculaire (mais peu importe). Tu découvres une mutation sur le gène DMPK chez les patients qui ont cette maladie. Une question intéressante est de savoir si la protéine DMPK est présente chez ces patients malgré la mutation Pour cela tu peux prendre des cellules de patients et de personnes saines et faire un western blot pour comparer la quantité de protéine DMPK dans ces deux conditions.  [...]

Western Blot et coomassie

Avec le bleu on a deux informations. la taille et la quantité. Par contre si vous avez un problème technique qui fait que vous produisez une protéine de taille identique a celle attendue mais pas celle attendue, vous ne le saurez jamais.  [...] Le western blot utilise pour révéler la protéine des anticorps spécifiques. On a donc deux (meme trois) informations. la taille, la quantité et la qualité. si vous détectez votre protéine vous êtes sur que c'est bien elle, pas d'usurpation possible. C'est une information de spécificité.  [...]

[biologie moléculaire] Info sur le slot blot

L'avantage su slot blot, c'est bien sur la rapidité de la manip. Par contre, le western blot apporte une information supplémentaire, la masse de la protéine liée par l'anticorps. Cela peut être très utile pour éviter d'avoir des faux positifs. si tu cherches une protéine de 30 kDa et que ton western révèle une protéine de 80 kDa, tu sais que c'est un faux positif. En slot blot, tu ne le sauras pas.  [...] Est-ce que grace à l'electrophorèse du western blot on peut avoir une idée de la taille et de la quantité de protéine recherchée.  [...]

mesure de l'expression d'un gene

Pour les techniques de marquage métabolique ou de western, les questions ne sont pas du tout les mêmes. L'un permet d'estimer la quantité de protéine synthétisée (attention aux protéines instables et rapidement dégradée), l'autre c'est la quantité de protéines présente à un temps donné (néosynthèse ou pas, dégradation ou pas).  [...] Je confirme que pour analyser rapidement la taux d'expression d'une protéine particulière, on utilise le western blot (WB). C'est une technique facile à mettre en oeuvre, éprouvée, qui permet de faire des comparaisons très rapidement (plusieurs échantillons en même temps) et relativement rapide.  [...]