• Forum - Quantité, Protéine, Conditions

[Biologie Cellulaire] Southern Blot, Northern Blot et Western Blot

Le but est bien de vérifier la présence d'une protéine (dans le cas du western blot) et de la quantifier (pour être exact ce n'est pas une quantification absolue mais c'est une mesure qui va permettre de comparer la quantité de la dite protéine entre deux conditions expérimentales.  [...] Petit exemple concret. admettons que tu travailles sur la maladie de Steinert, c'est une maladie musculaire (mais peu importe). Tu découvres une mutation sur le gène DMPK chez les patients qui ont cette maladie. Une question intéressante est de savoir si la protéine DMPK est présente chez ces patients malgré la mutation Pour cela tu peux prendre des cellules de patients et de personnes saines et faire un western blot pour comparer la quantité de protéine DMPK dans ces deux conditions.  [...]

[Biochimie] Induction d'une protéine

La 1ère étape de la manipulation consiste à mettre au point les conditions de surexpression de cette proteine, pour cela on dispose d'une préculture de bactéries recombinantes permettant de produire l'adénine désaminase, je dois différentes conditions d'inductions ( Milieu LB / Milieu TB) ainsi que variation de la quantité d'IPTG, la DO d'induction est de 0,6.  [...] Et enfin si j'ai bien compris, c'est normal que mes DO avec IPTG ne soient pas superieur aux DO sans IPTG, car la quantité de bactérie dans ma solution n'est pas liée à la surproduction de protéine engendrée par l'IPTG, dans ce cas je ne vois pas l'intérêt de faire une étude comparative.  [...]

[Biochimie] Au secours!

I - Une gamme étalon est réalisée à partir de sérumalbumine bovine (SAB), une protéine que l'on peut purifier en grande quantité à partir de sérum de boeuf, et qui est utilisée de ce fait comme protéine de référence. On admet par conséquent qu'un échantillon protéique d'origine biologique quelconque, d'absorbance A, a la même concentration en protéines qu'un échantillon de SAB traité dans les mêmes conditions et ayant la même absorbance A.  [...] La solution mère de SAB a pour concentration initiale C0 = 1 mg.mL-1*. une fraction aliquote de cette solution est diluée au 1/10è pour réaliser la gamme étalon sur la base des concentrations suivantes. 25 / 50 / 75 / et 100 µg.mL-1. Après addition du réactif de Bradford, les absorbances suivantes sont obtenues.   [...]

[Biotechnologie] Culture bactérienne et protéines recombinantes en plaque 96 puits

Je souhaite réaliser des tests d'expressions de protéines recombinantes (système bactérien) en format plaque 96 puits (différents vecteurs, TAG, condition de culture, souche bactérienne etc). Je suis à la recherche d'un système permettant, après la lyse du culot bactérien, de séparer rapidement les fractions solubles et insolubles des protéines, directement en système 96 puits.  [...] Je réalise déjà des tests d'expression de protéines recombinantes (sreening des meilleures conditions) mais en format tube...et ça prends beaucoup de place pour gérer la quantité d'échantillons. Habituellement, je réalise une étape de centrifugation à 15000g 30min 4°C en tubes, après la lyse bactérienne via un tampon de lyse commercial, pour séparer les fractions solubles/insolubles et analyser dans quelles fractions se trouvent la protéine produite (par SDS PAGE/WB/ELISA).  [...]

[Biologie Cellulaire] Infos protocole

- les conditions d'IP dépendent de la protéine à immunoprécipiter. sa localisation (membranaire, cytosolique, nucléaire) conditionne le type d'extraction protéique à effectuer, de son abondance va dépendre la quantité de lysat à utiliser.  [...] Si ta protéine est membranaire, il faudra vraissemblablement utiliser des tampons de lyse avec une forte quantité de détergent.  [...]

[Biochimie] Activité enzymatique

Donc tu fais une precipitation au Sulfate d'ammo, c'est quoi en détail ton protocole Peux tu doser la quantité de protéine avant et après precipitation Tes conditions expérimentales de mesure de cinétique sont elles identiques avant et après précipitation.  [...] Je dose mes protéines avant et aprés précipitation via la méthode de lowry en gardant tjrs les memes conditions expérimentales.  [...]

[Biochimie] Quantifier un western blot

le film a une gamme de réponse linéaire, le substrat aussi, la quantité d'anticorps joue aussi un rôle. C'est pour cela que l'idéal est d'avoir une gamme de quantité sur le même gel, et sur la même expo de la même protéine, pour t'assurer que tes conditions sont bien quantitatives.  [...] D'ailleurs, qu'en est il des protéines faisant partie de megacomplexe En SDS PAGE, tout est dénaturé, donc pas de problème, mais en ELISA, si le site est masqué Mes souvenirs d'ELISA remontent un peu, mais il ne me semble pas qu'on utilisait des conditions super stringentes ou je me trompe.  [...]

[Biologie Cellulaire] Fusion transcriptionnelle et traductionnelle

Maintenant si tu veux non plus localiser une protéine d'intérêt mais quantifier l'activité d'un promoteur donné entre plusieurs conditions, tu peux construire quelque chose comme [promoteur d'un gène d'intérêt]-[5'UTR]-ATG-séquence codante d'un gène rapporteur-STOP-[3'UTR et terminateur de transcription].  [...] Plus le promoteur sera actif dans la cellule plus le gène rapporteur sera transcrit plus il y aura la protéine codée par le gène rapporteur. Pour une quantification on n'utilise pas la GFP mais quelque chose comme la bêta glucuronidase par exemple, j'ai oublié la réaction mais plus tu auras de bêta glucuronidase plus tu auras un précipité bleu que tu pourras doser, renseignant sur l'activité initiale du promoteur de ton gène d'intérêt. c'est la fusion transcriptionnelle.  [...]

Vapeur d'eau dans les poumons = danger ?

Physiquement la quantité de vapeur dans l'air ne peut pas dépasser la quantité correspondant à la saturation, ce qui dépend de la température et la pression. Dans le cas indiqué, les conditions sont très proches des standard.  [...] Or il est très courant de respirer la quantité max en conditions standards. c'est ce qu'il se passe quand l'hygrométrie est de 100%, par définition, une condition pas vraiment rare en climat tropical ou dans une serre.  [...]

[Biochimie] Electrophorèse en condition dénaturante et native

Alors on réalise une électrophorèse sur la Bêta-Lactoglobuline (une protéine du lactosérum) dans les conditions natives, cette dernière donne une migration en deux bandes A et B d'égales intensités mais ayant des niveaux de migrations différents. Par contre, son électrophorèse en présence de Dodécyl sulfate de sodium (SDS), donne une migration en une bande unique dont le PM est évalué à 18300 Daltons.  [...] Je pense que lors de l'électrophorèse en conditions natives, la protéine est séparée en fonction de sa charge et de son poids moléculaire(PM) d'où la migration en deux bandes A et B. Quant à son électrophorèse en présence de SDS, la séparation de la protéine est en fonction de son PM seulement, je me trompe.  [...]