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Electrophorèse sds-page de la MMP2

sur le gel Page vous vouliez voir les MMP au bleu de coomassie ou toutes les protéines j'imagine que c 'est pour normaliser la quantité de MMP par rapport au total.  [...] Le bleu de coomassie est un colorant très peu sensible, il colore certes les protéines mais on ne voit à l'oeil que les bandes principales. Surtout que dans un surnageant cellulaire, la quantité de protéine est pas suffisamment importante pour voir des bandes. Peut être avec du nitrate d'argent.  [...]

[Génétique] Western blot

Je suis actuellement étudiante en Master 1 de génétique et je fais mon stage dans un labo de génétique et je fais beaucoup de Western Blot sur des lysats issus de lignées de liposarcomes. A chaque révélation des bandes, je constate que les bandes du contrôle que je met (la tubuline) ne sont pas identiques d'un puit à l'autre ce qui suggère que je n'ai pas déposé la même quantité de protéine dans chaque puit, mais pourtant je fais bien attention de bien déposer la même quantité de 20µl par puit (30µg de prot pour un QSP de 40µl avec du tampon de laemmli et du tampon de charge.  [...] Le dosage protéique a été effectué correctement. Je dois soumettre mes échantillons a différentes conditions (avec et sans inhibiteur) pour voir l'abondance d'expression des mes protéines selon la condition adéquate, donc il est impératif que la tubuline soit intacte pour tout mes puits pour que je puisse quantifier.  [...]

[Biochimie] Electrophorèse en condition dénaturante et native

Alors on réalise une électrophorèse sur la Bêta-Lactoglobuline (une protéine du lactosérum) dans les conditions natives, cette dernière donne une migration en deux bandes A et B d'égales intensités mais ayant des niveaux de migrations différents. Par contre, son électrophorèse en présence de Dodécyl sulfate de sodium (SDS), donne une migration en une bande unique dont le PM est évalué à 18300 Daltons.  [...] Je pense que lors de l'électrophorèse en conditions natives, la protéine est séparée en fonction de sa charge et de son poids moléculaire(PM) d'où la migration en deux bandes A et B. Quant à son électrophorèse en présence de SDS, la séparation de la protéine est en fonction de son PM seulement, je me trompe.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

Dans un deuxième temps j'ai produit un anticorps reconnaissant cette protéine et j'ai fait un western avec l'anticorps purifié. J'observe alors une bande au bon poids et d'autres plus petites (ne fait pas une smire, il n'y a que 3 bandes de plus).  [...] Tu me dis que des modifications de la protéine peuvent entrainer de gros shift lors de la migration. Est-ce que ça peut expliquer mes résultats. une bande attendue à 100 kDa, plus 2 autres à 60 kDa (doublet) et une dernière à 30 kDa.  [...]

Quel test statistique utiliser?

Je voudrais comparer le niveau d'expression d'une protéine entre des cellules transfectées et non transfectées. Pour cela j'ai réalisé un lysat cellulaire et fait migré mes protéines pour détecter ma protéine d'intérêt. J'ai par la suite quantifie l'intensité des bandes.  [...] Si tu souhaite avoir des données chiffrées, il faut utiliser un logiciel comme ImageJ qui permet de mesurer des intensités de bandes. Il faut alors ajuster les valeurs obtenues pour ta protéine en fonction des valeurs lues pour la protéine référence.  [...]

Moustiques résistants

Comme pour le WB, tu peux parfois comparer les bandes pour en déduire des quantités, ou dans tous les cas, la présence/absence du gène choisi.  [...] d'après les docs 2 et 3, la synthèse des protéines de type A se fait même en présence de très peu de gènes A, alors que pour la protéine B4, le gène B4 doit être présent en grande quantité.  [...]

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot

Et bien tu utilises un anticorps dirigée contre ta protéine de normalisation comme l'actine, la tubuline, le GAPDH... pour révéler sur la même membrane où tu as révélé ta protéine d'interêt. Si tu as déposé la même quantité de protéine dans les puits, ta protéine contrôle va te permettre de le confirmer visuellement.  [...] Même si le western n'est pas une méthode quantitative il est aussi possible de mesurer l'intensité de tes bandes avec un logiciel, et de normaliser ta prot d'interêt par rapport à ta protéine contrôle mais en général on se contente du visuel.  [...]

Quel test statistique utiliser?

Je cherche a détecter une différence significative du niveau d'expression d'une protéine entre des cellules transfectées et non transfectées. Pour cela, j'ai réalisé un lysat cellulaire, et fait migrer mes protéines. J'ai par la suite comparé le niveau d'expression de cette protéine en question par mesure de l'intensité des bandes.  [...] Ainsi je possède deux bandes, l'une de la protéine ds cellules transfectées et l'autre de la protéine des cellules non transfectées. Je voudrai maintenant savoir s'il existe unedifférence significative entre ces deux bandes... Est- ce faisable.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Mais pour mes protéines, je n ai aucune bande supérieure à 200kda. Evidement après incubation avec mon AC, je n ai pu rien révéler. Cependant, la b actine est tres bien révélée (beaucoup même, car j ai dû loader une quantité très élevée de protéines). Donc, je pense que.  [...] Le dot blot marche donc c'est plutôt bon signe, même si ça n'exclue pas tous les artefacts possibles liés à ton anticorps. S'agit-il d'un anticorps polyclonal ou monoclonal directement dirigé contre ta protéine ou d'un anticorps dirigé contre une étiquette que tu as ajouté Quand tu utilises cet anticorps, tu ne vois pas ta protéine mais vois-tu d'autres bandes plus petites ailleurs sur le gel Si tu vois des bandes plus petites, s'agit-il d'une bande unique (dans ce cas, il s'agit probablement d'une reconnaissance non spécifique d'une protéine qui n'a rien à voir) ou de plusieurs bandes et en particulier de bandes proches les unes des autres (dans ce cas c'est sans doute une dégradation partielle).  [...]

pH d'une solution protéique et Western-blot

J'ai retenté en mettant de la soude 2N (Cf=0,1M) et là j'ai obtenu mes bandes attendues mais il semble que ma protéine se soit dégradée car j'ai aussi des bandes à un poids moléculaire plus faible.  [...] C'est ce qu'il fallait faire. Si vous avez des bandes supplémentaires, c'est soit que votre protéine n'est pas pure, soit qu'elle a été dégradée avant l'analyse sur gel.  [...]