• Forum - Quantité, Protéine, Bactéries, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Clonage

Il est possible d'obtenir de grande quantité de protéine en le faisait produire par des bactéries ayant reçu le plasmide recombinant contenant le gène cible.  [...] Comment une bactérie peut elle traduire ce gène, ou plus précisément comment peut elle synthétiser la bonne protéine grâce a ce gène.  [...]

[Biochimie] Nickel et congélation ...

Ce peptide forme des corps d'inclusion justement d'où l'utilisation d'urée aussi pour les récupérer. En fait j'ai testé plusieurs choses et il faut que je recoupe tout ça. J'avais testé avec de la guanidine aussi mais là je retrouve mon peptide dans le culot après la lyse des bactéries.  [...] Heureusement que j'avais tout noter...ou presque...et oui mon problème se situe là... Je vais pas vous faire attendre plus longtemps j'aurai besoin d'un protocole de surproduction de protéine et de purification, ma prot fait dans les 15Kda et je l'avais fait par colonne de nickel.  [...]

[Biologie Cellulaire] Toujours problème de vecteurs...

Ben comme je disais dans ton autre sujet stabilité de l'ARNm, on utilise les plasmides non réplicatifs (sans origine de réplication, on appelle ça des plasmides suicide) surtout pour des études de régions régulatrices sur de courtes périodes.  [...] Par contre pour produire une protéine en quantité suffisante comme dans ton cas, il faut une ori à ton plasmide.  [...]

[Microbiologie] Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

On utilise aussi souvent les BL21 quand on veut faire des inductions d'expression proteiques par l'IPTG (certaines protéases sont inhibées dans ces bactéries). Elles poussent pas mal.  [...] La compétance est à tester sur boite en transformant les bactéries avec une quantité donnée d'un plasmide temoin. En général, par cette méthode on a un résultat qui va de 10 5 à 5.10 6. ce qui est largement suffisant pour vos besoins.  [...]

[Biotechnologie] Bloquer l'expression d'un gène chez la levure

Sinon y'a encore un truc qui me vient à l'esprit mais je ne suis pas certain que ce soit très rigoureux. tu n'inactive pas le gène endogène mais tu transfectes avec un plasmide surexprimant à fond le gène muté. La protéine mutée va rentrer en compétition avec la protéine sauvage et même si le gène sauvage est toujours actif tu va avoir de l'inhibition à cause de la grosse quantité de protéine mutée... Mais après ca dépend aussi du gène.  [...] Pour l'IPTG je ne suis pas certain qu'il fonctionne chez la levure... je rappelle a toute fin utile que c'est un promoteur bacterien. y'a peu de chance qu'il fonctionne dans la levure, surtout qu'il necessite la presence de la protéine LacI pour etre réprime.  [...]

Problème de rendement kit Maxiprep

Tu as dit que tu utilisais une souche d'expression, pour peu que ton gène possède tout son CDS et qu'il y a un promoteur dans le plasmide, si la bactérie l'exprime correctement il se peut que cette protéine ait un effet,  [...] bien souvent quand ca arrive, on observe plutot un auto-empoisonnement et donc elles ne se reproduisent pas, donc vu que tes bactéries se développent il n'ya pas auto-empoisonnement, mais on sait jamais, si c'est une protéine qui joue sur la régulation des plasmides ou sur les séquences génétiques (sans toucher au chromosome et donc a la viabilité) peut etre que ta protéine est la cause.  [...]

Les colonies satellites dans un milieu aditionné d'Ampicilline

Tu fais ta transfo sur l'antibio 2 ou 3 (tu as dis que tu avais 2 autres résistances sur ton plasmide qui ne doivent pas être altérées par ton insert). Ca veut dire que seul les bactéries portant le plasmide (transformées) seront sélectionnées.  [...] Dans un transformation classique (que ce soit avec des cellules électrocompétentes ou avec des chemocompétentes), tu dois laisser 1h tes bactéries dans du LB liquide (le temps que les bactéries qui possèdent le plasmide puissent exprimer la protéine donnant la résistance).  [...]

[Biologie Moléculaire] Proteines recombinantes

Je ne comprends pas comment on peut utiliser les plasmides pour produire des protéines pour l'utilisation médicale par exemple l'insuline (on tire profit de l'opéron lactose). Comment est-ce qu'on force les bactéries à garder le matériel génétique introduit et comment ça se fait qu'il y a une partie des bactéries qui n'est pas transformé par le plasmide (qu'est-ce qu'on fait avec cette partie).  [...] Les protéines n'ayant pas intégré le plasmide vont donc crever, on ne fait rien avec. Pourquoi toutes les bactéries n'intègrent pas le plasmide Pas vraiment de réponse, ça dépend de beaucoup de choses, c'est un peu comme les transfections pour les cellules eucaryote, tu n'as jamais 100% d'intégration et tu dois valider tes transfections.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

J'ai transformé des bactéries DH5alpha avec mon plasmide GST et mon plasmide GST-prot d'intérêt. Pour chaque transformation j'ai effectué un contrôle non induit. J'ai testé deux stragégies d'induction avec 1 mM IPTG. 2h à 37°C ou toute la nuit à 30°C.  [...] De la même manière j'ai co-migré un extrait protéique obtenu après transformation des bactéries avec un pGEX vide et là aussi la colonne reste entièrement vide. Ces contrôles signifient bien que mon anticorps ne marque pas une protéine bactérienne endogène ou un bidule provoqué par l'insertion du seul plasmide.  [...]

[Microbiologie] bacterie resistantes

- Lorsqu'on insère un plasmide dans des bactéries, certaines bactéries du lot n'insèrent pas le plasmide et restent donc non résistantes.  [...] En faisant un milieu de culture normal, tu auras donc développement de colonies bactériennes résistantes à ton antibiotique, mais aussi de colonies non résistantes.  [...]