• Forum - Quantité, Enzyme, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Calcul d'unités enzymatiques

Je dois calculer la quantité théorique d'enzyme de restriction Bam HI et Hind III a utiliser pour digérer 1 microgramme de plasmide pSK et 1microgramme de plasmide pCR-gai ds les conditions standards.  [...] Je connais la définition d une unité d'enzyme de restriction mais je ne comprends pas comment interpréter 1microgramme d'ADN du phage lambda alors qu'on nous donne 50kpb... Y a t il une conversion a faire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression d'un gène d'enzyme !

un viel homme a isolé une petite quantité d'attractase,une enzyme produisant une phéromone humaine puissante,à partir d'echantillon de cheveux de célébrités hollywoodiennes.Pour produire de l'attractase à son usage personnel,il a obtenu un clone génomique complet du gène de l'attractase,l'a connecté à un promoteur bactérien puissant dans un plasmide d'expression et a introduit le plasmide dans des cellules d'E coli.  [...] il a été anéanti de découvrir qu'aucune attractase n'etait produite par les cellules.Quelle est 'explication de son echec.   [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

Une question. quelle quantité d'ADN plasmidique devrais-je mettre Mon plasmide a une concentration de 150 ng/ul, j'ai fait mon calcul pour le nombre d'unités d'enzyme pour 1 ug d'ADN plasmidique. Est-ce une quantité cohérente (mon clonage ultérieur sera un peu ch****).  [...] Je me demandais si cette quantité de plasmide est donc suffisante pour ce que je veux faire (c'est la toute première fois que je fais un protocole de digestion ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Voilà, donc pour les infos. mon insert fait environ 700 pb, et je vais utiliser comme vecteur le plasmide pBluescript SK, et je sais quelles enzymes je vais utiliser. Si vous avez une idée de protocole, des quantités, des temps d'incubation et tout je suis preneuse.  [...] A chaque étape, pensez à faire migrer 200/300ng du plasmide pour vous assurer que l'enzyme a coupé. En contrôle on fait migrer la même quantité de plasmide non coupé. A la seconde étape vous pouvez aussi éventuellement ajouter du plasmide non coupé que vous digèrerez avec la seconde enzyme.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation ADN plasmidique insert

On me demande de préparer le protocole.nous avons un phage m13 en quantité de 20 à 50 ng que l'On fait digérer par une enzyme adéquate puis on traite à la phosphatase alcaline Pour éviter que le plasmide ne se referme sur lui même.  [...] et on l'a introduit dans une bactérie de souche E.Coli alors que dans tout les exercices fait en TD c'était des plasmides qui était modifié et intégré dans une bactérie.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage dans plasmide

On me dit qu'un chercheur a isolé une petite quantité d'une certaine enzyme. Il a ensuite obtenu un clone génomique complet du géne codant l'enzyme, puis il le lia à un promoteur bactérien fort sur un plasmide. Une fois le plasmide introduit dans E.coli, il constata qu'aucune enzyme n'était produite.  [...] Il se peut en effet que ton gène soit mal inséré dans le plasmide ou pas du tout. De même si le plasmide qui est dans la bactérie n'est pas sous forme circulaire mais linéaire (à cause par exemple d'un mauvais choix d'enzymes de restriction lors de l'insertion du gène) il ne sera pas transcrit par la bactérie.  [...]

[Biochimie] Calcul d'une concentration en ADN

Je suis peut être en train de bloquer sur quelque chose de simple mais je ne vois pas du tout comment faire, et pourtant j'y ai réfléchi. On sait également que le plasmide est de 3500pb, mais je ne vois pas en quoi cela nous aide. 3500pb peut-il correspondre à la quantité d'ADN en moles.  [...] Comme on me demande la concentration je présume que je dois d'abord calculer la masse de plasmide ainsi que sa masse molaire, et en déduire la quantité de matière de plasmide, et diviser par le volume. Suis-je ok cette fois ci.  [...]

[Biologie Moléculaire] Utilisation de Klenow

Je viens de digerer un plasmide (pour le lineariser) avec une enzyme creant des bout cohesifs (extremite 5' depassant). Je voudrais rendre cette extrimite blunt en utilisant une klenow.  [...] il faut inactiver l'enzyme préalablement, sinon elle va continuer a couper. Pas besoin de purifier le plasmide, tu peux le faire ensuite. Il faut quand même que la klenow puisse fonctionner dans le tampon utilisé pour la digestion.  [...]

[Génétique] Analyse plasmides recombinants/non recombinants

Alors voilà. On a le plasmide pBSK qui fait 3 kb. Le technicien de laboratoire a dans un premier temps clivé ce plasmide grâce à une enzyme de restriction (EcoRI) au niveau d'un site multiple de clonage situé au niveau de l'opérons lactose puis l'a transféré dans une bactérie d'E.  [...] Concernant ta question du puit 6, je serait presque pret à parier que ce que tu vois est ton plasmide B (donc ta matrice) mise en trop grande quantité. Ca ressemble à du plasmide et comme ni ta pcr dans le puit 5 (tu as parlé d'une erreur de manipulation) ni dans le puit 7 (pourquoi) n'ont fonctionné, je serait tenté de dire qu'aucune de tes PCR n'a marché malheureusement.  [...]

clonages

j'ai quelques questions techniques à propos des clonages. Lorsque l'on utilise 2 enzymes de restriction qui nécessitent la digestion sequentielle du vecteur, j'imagine que vous précipitez le plasmide entre les deux digestions enzymatiques Purifiez vous l'insert avant la ligation avec le plasmide Moi je ne purifie pas parce que je trouve qu'une gel extraction ou une précipitation fait perdre bcp d'insert, surtout que je précipite déja entre les deux digestions enzymatiques.  [...] Une autre question pour améliorer mes clonages est. quelle quantité de plasmide faut il mettre dans le mix de ligation...j'ai pris 100ng de plasmide avec un rapport plasmide/insert d'environ 1/3 et 1/5.  [...]