• Forum - Quantité, ARN, Ménage

Quantification d'ADNc après une reverse transcription

J'ai arrêté de normaliser avec un gène de ménage (ca n'a aucun sens à mon avis). En théorie, le fait de partir d'une quantité d'ARN constante est une normalisation suffisante.  [...] En tout cas pour les manips futures, je suis bien tenté d'appliquer la méthode de 5ng d'ARN initial par point. Mesurer la quantité de cDNA me parait plus introduire un biais supplémentaire qu'autre chose.  [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

L'idéal est de confirmer que tu as bien pris la même quantité d'ARN en quantifiiant aussi un gène de ménage (qui ne varie pas en fonction du traitement ou de la pathologie), et ce gène de ménage doit être au meme niveau dans tes 2 echantillons. Si ce n'est pas le cas, c'est que tu as.  [...] Au fait quand tu fais ton extraction, ce sont des ARN totaux ou des ARNm spécifiquement Si effectivement tes cellules expriment des quantités différentes d'ARN, faudrait voir la part des messagers par rapports aux autres, pour voir lors de ton dosage par spectro si des différences d'expression des ARNm influent bcp sur la quantité calculée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation PCRq en temps réel (SYBER Green)

Le nombre de copie permet de revenir à une sorte d'unité internationale, car à partir des conditions expérimentales qui peuvent varier d'un manipulateur à l'autre (quantité d'ARN de départ, conditions de qPCR, mix utilisés etc...) les Ct peuvent varier. Après une normalisation par un gène de ménage défini et/ou l'utilisation d'une gamme étalon, on s'affranchit de ce genre de problème.  [...] Tu peux donc effectivement définir un pourcentage de contamination par rapport à la quantité totale d'ADN (ce qui me paraît être le plus simple).  [...]

[Biologie Moléculaire] couplage inverse ARNm - protéine ??

Ce qui détermine la quantité d'une protéine, c'est la vitesse de la traduction, la quantité d'un messager, mais aussi la durée de vie de la protéine. Il existe une multitude de systèmes qui contrôlent la durée de vie d'une protéine. Peut être que la différence entre tes rats est ici.  [...] Pour confirmer des quantités d'ARNm, une seule solution. comparer avec la production d'ARNm dit de ménage, des ARNm transcrits de manière constante comme l'ARN 16S et reflétant ainsi l'activité de votre cellule. Si votre quantité d'ARNm varie différemment de celle des 16S, cette variation vient bien d'un mécanisme de régulation.  [...]

[Biologie Moléculaire] quantitative/real time PCR quelle différence?

Il n'y a pas besoin d'etre quantitatif vu qu'a la base l'urine doit etre sterile. De plus quantifier sous entends normaliser les echantillons, utiliser un gene de menage, une gamme de quantification, des oligos parfaits etc... -. complique et sans interet.  [...] Merci pour toutes vos réponses. Si j'ai bien compris, la PCR en temps réel (après reverse transcription dans ce cas) repose sur la détection de la fluorescence à chaque cycle à l'aide d'un thermocycleur et elle peut être quantitative (normalisation de la quantité d'ARN de départ dans tous les échantillons, choisir un gène de ménage, réalisation de gammes.  [...]

Transcription et traduction des gènes

Voilà ce que j'ai appris il y a quelques années. l'épissage se déroule dans un deuxième temps. (l'ARN transcrit s'appelle le transcrit primaire, la modification des extrémités le transforme en préARNm, puis l'épissage en ARNm). Aujourd'hui ce mécanisme est remis en cause il semblerait que la maturation débute alors que le transcrit est encore en cours de synthèse.  [...] Concernant le dernier point, j'ai pensé a la coiffe et au poly A car ils protégeaient l'ARNm des exonucléase, donc de la dégradation, forcément si on enlevait ces 2 parties l'ARNm sera dégradé, peut être que je me trompe, mais c'est ma propre déduction, si quelqu'un pouvait me confirmer, ça serait sympas.   [...]

[Biologie Moléculaire] Calibration qRT-PCR sur cellule unique

Je me demandais dans le cas où l'on réalise une qRT-PCR sur les ARNm provenant d'une cellule unique, est ce qu'on doit partir de la même quantité d'ARNm pour tous les échantillons ou comme c'est les ARNm d'une seule cellule on peut s'affranchir de ce biais puisque l'on compare les niveaux d'expression d'un gène d'une cellule à une autre ( la variabilité des quantité d'ARNm serait inter-cellules) et bien sur en utilisant un gène de ménage comme référence pour chaque échantillon. Je ne sais pas si j'ai été claire.  [...] D'un point de vue théorique, je dirais que non. On fait cela pour partir sur une base commune et éviter tout risque lié à une inhibition du à une quantité trop importante de cibles.  [...]

Gène de ménage (gène de référence...)

- Et ensuite... Comment J'ai compris que l'on devait choisir un gène qui ne changeait pas mais dans l'exemple vu en cours le professeur a expliqué que par exemple dans 3 échantillons (une référence, une condition 1 et une condition 2) on avait une quantité totale d'ARN égale mais une quantité d'ARNm à quantifier et d'ARN du gène standard en quantité différente.  [...] Ce que tu vas donc faire c'est faire une qPCR pour quantifier le TGFB et un gène de ménage (ex. GAPDH) dans chaque échantillon. Ensuite tu vas faire le delta CT entre la Ct du TGFB et celle de la GAPDH. Etant donné que tu as la même quantité totale d'ARN dans tes échantillons la Ct de la GAPDH ne devrait pas beaucoup changer (puisque c'est ton gène de référence) par contre celle du TGFB oui.  [...]

[Biologie Moléculaire] Q PCR - méthode de quantification relative

Ca doit être a peu près ce rapport, mais c'est l'inverse. Un Ct plus petit = une expression plus forte. Donc plus chez le A que chez le B.   [...] Le gène de ménage est votre témoin. Le problème avec l'ARN est que les quantités récupérées peuvent varier en fonction de beaucoup de paramètres. Pour être sur que le seul paramètre qu'on mesure soit celui de l'expression de ce gène, on le pondère par ce qu'on appelle un gène de ménage autrement dit un gène exprimé tout le temps dans les cellules à des taux constants car indispensables à la cellule pour son bon fonctionnement. L'exemple classique est les ARNr.  [...]

[Biologie Moléculaire] Séquence validée pour sonde GAPDH

Je suis étudiant en thèse. Je suis actuellement en train de mettre au point un Northern blot afin de valider la spécificité d'une sonde pour mon gène d'intérêt, sonde que j'utiliserai ensuite pour étudier la néobiosynthèse des ARNm de ce gène par transcription run-off.   [...] Problème. je n'obtiens qu'un ladder d'ARN marqué. J'essaie donc de savoir si ce problème de spécificité de ma sonde est du à un problème de conditions d'hybridation ou à la sonde elle-même. Je cherche donc une sonde pour un gène de ménage dont la spécificité est avérée.  [...]