• Forum - Quantité, ARN, échantillons

Gène de ménage (gène de référence...)

dans 3 échantillons (une référence, une condition 1 et une condition 2) on avait une quantité totale d'ARN égale mais une quantité d'ARNm à quantifier et d'ARN du gène standard en quantité différente. Ok, mais, comment on a introduit l'ARN standard dans l'expérience.  [...] Tu peux par exemple en utilisant un nanodrop connaitre la quantité d'ARN que tu as dans ton échantillon. Si tu t'intéresses à un ARN en particulier par exemple la transcription du facteur de croissance TGFB par rapport à différent stimuli tu auras une quantité de cet ARN qui sera différentes en fonction de ton échantillon 1 et 2.  [...]

PCR, taux d'expression de la β-actine

D'ailleurs, quand on travaille très proprement, on peut avoir de très bons résultats sans normaliser, simplement parce qu'en préparant ses ARN, sa RT, ses dilutions et tout, on part sur une quantité d'ADNc connue et identique pour tous les échantillons.  [...] Ce que je voulais dire, c'est que quand on met au point une qPCR et qu'on a le choix entre différents gènes de ménages (= différents gènes qui ne sont pas censés varier, je suis ok avec ça) lorsque l'on utilise telle drogue/anticorps/traitement sur ses cellules par exemple, on prend soin de tester avant que c'est bien le cas (ou plus ou moins le cas).   [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

L'idéal est de confirmer que tu as bien pris la même quantité d'ARN en quantifiiant aussi un gène de ménage (qui ne varie pas en fonction du traitement ou de la pathologie), et ce gène de ménage doit être au meme niveau dans tes 2 echantillons. Si ce n'est pas le cas, c'est que tu as.  [...] Donc en fait l'idéal serait que j'ai une idée du nombre de cellules présent dans mon échantillon pour pouvoir ramener ma quantité d'ARN total à un nombre de cellules pour vraiment voir ce phénomène de dilution.  [...]

[Biologie Moléculaire] quantitative/real time PCR quelle différence?

Il n'y a pas besoin d'etre quantitatif vu qu'a la base l'urine doit etre sterile. De plus quantifier sous entends normaliser les echantillons, utiliser un gene de menage, une gamme de quantification, des oligos parfaits etc... -. complique et sans interet.  [...] Merci pour toutes vos réponses. Si j'ai bien compris, la PCR en temps réel (après reverse transcription dans ce cas) repose sur la détection de la fluorescence à chaque cycle à l'aide d'un thermocycleur et elle peut être quantitative (normalisation de la quantité d'ARN de départ dans tous les échantillons, choisir un gène de ménage, réalisation de gammes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Quantité d'ARN pour PCRq

J'aurais aimé savoir quel est la quantité requise en ARN pour faire de la PCRq. J'imagine que ca dépend de la sensibilité de la machine, mais c'est juste pour avoir un ordre d'idée car comme je fais la microextraction savoir si je suis vraiment loin du compte ou si ma microextraction suffit et évitera de pooler des échantillons.  [...] Ca le fait très très très largement, pas d'inquiètude, l'ARN que j'extrais n'est même pas dosable au nanodrop vu la mince quantité mais en faisant une RT avec des random hexameres pour améliorer le rendement, les ADNc fonctionnent très bien en PCRq.  [...]

[Biotechnologie] Comment déterminer le rendement d'une RT?

La seule methode pour determiner un rendement de RT est de rajouter un ARN de synthese pur et de quantitee connue. Si tu sais combien tu met de cet ARN au depart, tu va le traiter comme les autres lors de la RT et lors de ta PCR tu va quantifier ton ADNc provenant de cet ARN en meme temps que tes echantillons.  [...] Ce qui est chiant c'est de trouver un ARN dont tu es sur qu'il n'a aucun competiteur dans ton echantillon. Certaines compagnies on speciallement cree ce genre d'ARN qui n'a d'homologue chez aucune espece sequence a ce jour. Forcement, c'est rare donc c'est cher.  [...]

[Biologie Moléculaire] j'ai besoin d'aide concernant mes echantillons d'ARN

j'ai eu des echantillons d'ARN tres concentrés apres dosage par spectro,quand j'ai fait le calcule pour faire la reverse transcription,le volume que je dois prelever est tro petit à prelever(=de 0.44µl)alors que ma pipette mesure à partir de 0.5µl,je ne sais pas quoi faire.  [...] tu dilues 2x ton échantillon, et tu prélèves 0.88ul de cette dilution au lieu de 0.44ul de la solution concentrée. Sinon c'est encore plus simple de diluer 10X et de prélever 4.4ul (plus les volumes sont importants, plus les erreurs sont proportionnellement faibles).  [...]

MCF7 cellules cancéreuses, 3 bandes ARN?

non ce que je ne comprend pas c'est la 3 ème bande obsérvé lors de mes dépots d'ARN extrait dans chacun de mes échantillons pour n'importe quel puit.  [...] effectivement mes échantillons d'ARN sont extraits o trizol (phénol-isothiocyanate de guanidine)-chloroforme, précipités à l'isopropanol et lavé à l'éthanol. protocole classique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Calibration qRT-PCR sur cellule unique

Je me demandais dans le cas où l'on réalise une qRT-PCR sur les ARNm provenant d'une cellule unique, est ce qu'on doit partir de la même quantité d'ARNm pour tous les échantillons ou comme c'est les ARNm d'une seule cellule on peut s'affranchir de ce biais puisque l'on compare les niveaux d'expression d'un gène d'une cellule à une autre ( la variabilité des quantité d'ARNm serait inter-cellules) et bien sur en utilisant un gène de ménage comme référence pour chaque échantillon. Je ne sais pas si j'ai été claire.  [...] D'un point de vue théorique, je dirais que non. On fait cela pour partir sur une base commune et éviter tout risque lié à une inhibition du à une quantité trop importante de cibles.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comparaison de plaque qPCR

Tu dois avoir des gènes des référence parmi les couples de primers que tu as utilisé. Le principe est que pendant la RT, tu as utilisé une quantité (à peu près) connue d'ARN. Or tu ne peux pas être sur que la RT s'est déroulée identiquement dans tous tes échantillons.  [...] Je récupère les MT de chaque référence pour les plaques selon l'espèce recherchée, puis je calcule le CT moyen de chaque référence, je trace ensuite une courbe Ct observé en fonction du Ct moyen et grace à l'équation de chaque droite, j'obtiens une correction que j'applique sur tous les echantillons de ma plaque.  [...]