• Forum - Quantité, Amorces, ARN

Mesurer le degré d'activité des gènes des cellules

Pour savoir comment un gène s'exprime tu as la qRT-PCR qui te permet de connaitre la quantité d'un ARN que tu connais et pour lequel tu as défini des amorces dans ton tissu.  [...] Oui, il existe de nombreuses méthodes pour savoir comment, quand et où un gène s'exprime, quantitativement et qualitativement. Quant au nombre de gènes actifs, ce n'est pas une donnée intéressante.  [...]

[Microbiologie] Viabilité d'une bactérie et ARN - Page 2

Les temps de polymérisation en qPCR sont trop court pour pouvoir amplifier un intron souvent supérieur à 1 kb. En procédant comme dit Flyingbike, tu n'auras pas de problème a priori. Une faible quantité d'ADNc est suffisante pour la qPCR donc à ta place je tenterais le coup en faisant une petite qPCR de tes ADNc en prenant des amorces ciblant un gène bien exprimé comme l'ARN 18S.  [...] à ta place je tenterais le coup en faisant une petite qPCR de tes ADNc en prenant des amorces ciblant un gène bien exprimé comme l'ARN 18S. Si le Ct sort tard (au-dessus de 25 cycles pour ce gène cela me parait déjà tard), alors tu pourras déduire que ta quantité d'ADNc est insuffisante.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr quantitative eficacité de la pcr

Pour améliorer l'efficacité, il faut jouer sur la pureté et la quantité de tes ADN (car on amplifie des ADNc, pas les ARN en quantitatif), les temps et température des différentes étapes, la concentration en MgCl2 et en amorces.  [...] Si tu utilises la méthode du delta Ct. si les efficacités des PCR ne sont pas identiques (ou au moins relativement proches), les pentes des droites (que tu génères en quantification absolue) ne seront pas parallèles, et tu vas introduire un biais dans tes calculs.  [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

edit. vu la différence de quantité d'ARN, as tu fait un gel d'ARN pour vérifier l'intégrité des ARN dans l'échantillon le moins concentré Y a t il un traitement à la DNase pour t'assurer que tu n'amplifies pas le génomique qui aurait pu cntaminer l'échantillon le plus concentré D'ailleurs les amorces chevauchent elles des jonctions exon/exon, pour éviter d'amplifier l'ADN As tu un controle sans RT (donc pour lequel il n'y a pas de cDNA et qui théoriquement ne doit rien donner en qPCR ).  [...] Au fait quand tu fais ton extraction, ce sont des ARN totaux ou des ARNm spécifiquement Si effectivement tes cellules expriment des quantités différentes d'ARN, faudrait voir la part des messagers par rapports aux autres, pour voir lors de ton dosage par spectro si des différences d'expression des ARNm influent bcp sur la quantité calculée.  [...]

[Génétique] Extraction, purification et analyse d'ARN (Nanodrop et bioanalyser)

Héhé, bonne question. En principe tu as autant d'ARNm que de cDNA, plus tous les ARN non rétrotranscrits (donc ARNt et r). Perso, lorsque je fais une RT avec des pDN6 (des amorces de 6 nucléotides aléatoires, donc potentiellement non sélectifs du type d'ARN) la quantité d'acides nucléiques double apres la RT.  [...] Pour les PCR classiques on utilise toujours des amorces ADN. C'est plus facile a synthétiser et a manipuler. In vivo pour la réplication il y a synthese d'amorces ARN par la primase qui sont ensuite remplacées par de l'ADN mais en PCR il n'y a pas de raison.  [...]

Gène de contrôle de dépôt

je compte faire de la PCR semi-quantitative sur des ARN extraits de ganglions rachidiens. J'ai les amorces pour mon gène d'intérêt mais il me manque un couple d'amorces pour amplifier un gène de contrôle.  [...] j'aurais tendance a penser que de maniere generale l'actine ou la tubuline sont de bons controles puisque ces proteines sont constitutivement fortement exprimées.   [...]

Synthèse du brin retardé d'ADN

-L'ADN polymérase I sert à dégrader les amorces d'ARN grâce à son activité 5'3' exonucléase et les remplacer par de l'ADN grâce à son activité polymérase.  [...] A quel moment intervient la ligase Avant on après le remplacement des amorces ARN par de l'ADN Obtient-on d'abord un brin hybride ADN/ARN pour ensuite faire intervenir l'ARN polymérase I et obtenir un brin d'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] ADN pol I

Tu dis que c'est l'activité 3'-5' de la Pol I qui dégrade les amorces ARN ça veut dire que la Pol revient en arrière (3'-5') en dégradant l'amorce ARN, puis elle resynthétise le tout en 5'-3'.  [...] Quoiqu'il en soit, Guillaume 69, lui ^^, dis la vérité... une amorce d'ADN fonctionne... mais il me semble ( soyons prudent maintenant ^^), que c'est bien de l'ADN qui amorce l'activité 5'-3' de la pol I lorsqu'elle comble les espaces libérés par la destruction des amorces d'ARN... voilà ^^.  [...]

[Biologie Moléculaire] replication d'ADN

oui bien sure qu'on synthétise les amorces d'ARN à partir d'ARN polymerase mais est ce au moment de la réplication je veux dire est-ce que ces amorces n'ont pas eté présentes avant la replication et elles ne les reste que s'ybrider.  [...] une amorce d'arn est synthétisée sur le leading strand lors de l'inititiation. Mais pour le brin tardif, la Pol alpha-Primase synthétise des amorces d'ARN pour chaque fragment d'okazaki. Donc pas uniquement lors de l'initiation de la réplication.  [...]

[Biologie Moléculaire] Réplication de l'ADN chez les eucaryotes SOS

Une fois la réplication terminée, il n'y a plus d'amorces d'ARN. c'est au cours de la réplication que ces amorces sont retirées par l'ADN polymérase.  [...] Et une dernière question pour les procaryotes cette fois-ci,il est dit dans mon cours que l'amorce d'ARN est hydrolysée par la RnaseH (=exo..5'3')et que les amorces sont synthétisés en ADN par l'ADN pol I Cela signifie bien que chez les procaryotes l'exo.  [...]