• Forum - Puits, Plasmide, Bactéries

[Microbiologie] transformation

je dois cloner les produits de digestion de la mutagenèse (insert ADN) dans le vecteur PGEX4T1 en transformant les bactéries compétentes DH5± J'ai trouvé des clones sur un milieu 2YT/AMP j'ai fait une miniprep pour extraire le plasmide recombinant simplement sur le gel les produits sont piégés dans le puits j'ai refait la manip à plusieurs reprises je trouve toujours le même résultat avec un smear Aidez moi que devrais je faire.  [...] Ton smear vient des bactéries je pense. Et ce que tu as dans tes puits c'est probablement ton plasmide avec l ADNg de tes bacteries.  [...]

[Génétique] Analyse plasmides recombinants/non recombinants

coli. Ensuite il a fait une sélection blanc/bleu pour distinguer les bactéries contenant les plasmides recombinants des non recombinants. Ensuite, on nous a donné à nous, les étudiants, deux souches A et B. On nous a demandé de lyse les bactéries, puis après plusieurs étapes de purification on a obtenu les plasmides seuls.  [...] Le probleme c'est que pour le puits 6 je ne sais pas quoi déduire... Pourquoi y a t il 2 bandes La bande a 3000 correspondrait à un excès de plasmides non recombinants et la bande a 6000 mon plasmide contenant l'insert Le soucis c'est que quand j'ai lysé les bactéries, je n'en n'ai vu aucune de bleue dans le culot contrairement à l'échantillon A.  [...]

interpretation electrophorese d'un plasmide purifié

Bonjour et bien non y'a pas eu digestion par des enzymes en fait on just purifier et on a fait une electrophorese. on a plusieurs puits parcequ'on etait nombreux et chacun a deposer son plasmide purifie.Merci.  [...] moi je vois qu'on a deux bandes une légère qui correspond a l'ADN génomique de la bactérie et la bande épaisse en dessous c'est notre plasmide circulaire purifié.  [...]

[Biochimie] Calculer la taille d'un fragment dans une carte de restriction

Mais là je ne me servirais même pas de ça. Tu as un plasmide rond dont tu connais la taille, un insert dont tu peux connaitre la taille d'après le puits 1, et tu peux découvrir la position des sites claI et PstI dans cet insert par les 2 et 3.  [...] Du puits 2, tu vois que t'as deux sites de coupure ClaI dans ton plasmide + insert. Hors le plasmide seul n'en a qu'un. Conclusion, ton insert a aussi un site de coupure ClaI. Tu peux donc donner une position possible à ce site dans ton insert. Tu fais pareil avec PstI et ainsi tu pourras savoir la taille des différents fragments.  [...]

[Biologie Moléculaire] Efficacité de transfection

Jusque là tout va bien. Mon problème c'est V. Il s'agit dixit du volume total. mais à quoi correspond-il Au volume total de réactif de transfection + plasmide ou bien plutot au volume total de chaque cupule.  [...] Donc ma question est la suivante. quelqu'un peut-il m'expliciter la formule d'efficacité de transfection qui pourtant devrait revenir au meme qu'une formule d'Efficacité de transformation mais comme on travaille directement sur culture de cellules au lieu de travailler sur gélose comme pour la transfo bactérienn, et bien c'est bête mais on s'y perd.  [...]

[Biologie Cellulaire] Triple transfection

De même, je pense qu'il faut utiliser un même nombre de chaque plasmide (en tenant compte de leur taille respective) plutôt que de mettre par exemple 4ug de chaque (je bosse en plaque de 6 puits).  [...] Et en effet mettre le même nombre de plasmide est mieux que des quantités d'ADN arbitraire surtout si tes plasmides sont vraiment différents en taille. Veille aussi à ne pas dépasser la quantité maximale d'ADN à transfecter dans chaque puits (qui est la même que pour une transfection simple).  [...]

[Biochimie] Restriction bizarre

Je dirais donc que dans le puits 1 il y a les formes superenroulée (bande du bas) et circulaire relâchée (bande du haut) du plasmide. Avec BgIII il y a 2 coupures vu qu'on observe deux morceaux d'ADN, et avec PvuII il n'y a qu'une coupure et on obtient la forme linéaire du plasmide.  [...] et pour BGIII. minimum 2 bandes (si le site ou a été coupé le plasmide est un des sites de restriction de BGIII) ou 3 bandes. Mais ou ce placeraient elles sur le gel.  [...]

[Biologie Moléculaire] Deux bandes en PCR

Des plasmides C'est pour tester des clones avec un insert Juste comme ça, le plasmide vide donne une bande Normalement oui. A quelle taille.  [...] Tous les groupes ont les deux bandes sauf un Vous travaillez tous avec le même plasmide ou vous avez fait chacun une prep à partir d'une colonie bactérienne.  [...]

[Biologie Cellulaire] Transfection plasmide B-gal sur 3T3

Je dois effectuer une transfection de plasmide B-galactosidase dans des cellules 3T3. Voila le principe de la dernière manip effectuée.  [...] Pour ton plasmide, tu as raison de faire varier ta quantité. Quand tu dis préparation à 0.5µg (3 puits), tu déposes 0,5µg par puits ou bien 0,5µg pour 3 puits Normalement 500ng pour un puits ça suffit, surtout pour la B-Gal.  [...]

[Identification] taxonomie moléculaire

pour revenir au sujet, voici une technique de microbiologie qui permet une classification des bacteries. c'est ce que l'on appelle la 'gallerie API', on test les bacteries sur different puits avec differents substrats, et selon la couleur du puit on peut determiner si la bacterie est capable d'utiliser ou non un substrat, entre autre si elle possede tel enzyme ou pas.  [...] selon les resultats obtenus il existe une sorte d'annuaire des bacteries qui permet de classer ou de determiner quelle est la bacterie sur laquelle tu travailles. l'explication en detail de chaque manip est longue a expliquer mais le mot cle c'est 'gallerie API'.  [...]