• Forum - Puits, ADN, Protéine

[Biologie Moléculaire] élèctrophorèse (ADN)

Donc, si tu n'observes pas de bande dans un puits c'est que le poids moléculaire de l'ADN fragmenté n'est pas dans la fourchette de taille observable par le gel d'agarose calibré (autrement dit, ton ADN est tellement petit qu'il a pu passer a travers ce maille et que lors de la migration, il a carrément quitter le gel en migrant vers une électrode).  [...] Par contre, j'ai du mal m'exprimer, ce que je n'arrive pas à expliquer c'est pourquoi à T0 on voit une migration avec nottament une barre près du puits, à T1 la migration est de même longueur sauf que la barre près du puits apparait moins nettement, et à T2 la migration est bien visible aussi mais il n'y a plus de barre tout près du puits.  [...]

[Biologie Moléculaire] électrophorèse en champ pulsé

mon souci c'est que ca soit un prob d'ADN (pas d'ADN sur mes plugs) par contre j'ai vue une fluorescence au niveau des puits mais je ne c'est pas si ca s'interprète avec présence d'ADN ou ca se vois même avec un témoins négatif.  [...] je ne sais pas est ce que c'est probléme d'enzyme condition d'incubation ou pas bien mélanger ou il n y a pas d'ADN déjà (plugs mal préparé) vraiment j'ai peur que ca soit question d'ADN a votre avis la fluorescance qui est dans les puits ca correspond a quoi et pkoi a votre avis il n y a pas de migration.  [...]

[Biologie Moléculaire] Electrophorese gel d'agarose

le principe de l'électrophorèse est de faire migré l'ADN a laide d'un courant électrique a travers le gel. Comme dit, au dessus l'ADN a été introduit dans un petit trou dans le gel appelé puits, placé du coté de la l'anode (-).  [...] Après migration tu observe une ou plusieurs bandes, tu compare la distance puits/bande à celle de ton ADN à celui du marqueur et tu peu déterminer sa taille.  [...]

[Génétique] Analyse plasmides recombinants/non recombinants

Ensuite, avec différents échantillons, on a fait pour A et B, une PCR, une digestion par EcoRI puis on a fait migrer ces deux produits dans un gel dagarose 1% avec l'ADN A et B non digéré. Au final on a 10 puits.  [...] Ensuite pour le puits 7, c'est normal, c'est un témoins ou l'ADN n'a pas été ajouté. Concernant le puits 5, je ne sais pas trop, étant donné que nous ne devions ajouter qu'un microlitre d'ADN à notre préparation, je pense que j'ai du commettre une erreur à ce moment là.  [...]

Estimation concentration gel agarose

J'ai déposé dans le premier puits 2µL de gene ruler DNA mix, dans le 2eme puits 4µL et dans le 3eme 6µL. j'ai ensuite déposé dans un puits 6µL de mon ADN et dans un autre puits 12µL de mon ADN.  [...] Pour connaitre la concentration il faut utiliser un spectrophotomètre micro-volume (type Nanodrop), c'est la seule façon de réellement connaitre la quantité d'ADN présent.  [...]

[Biologie Moléculaire] ARN et contaminants

Comme je pense que tu as quand même fait suffisement migré (voire trop si c'est de la manip dont tu parlais dans un post précédent) (le colorant bleu ayant migré jusqu'au 1/3-2/3 du gel. A l'inverse d'un gel de protéine, on ne fait jamais sortir le bleu sur un gel d'agarose), il n'est pas possible que ce ne soit que des ARN, car dans ces conditions (gel agarose 1%), il faudrait que tes ARN fassent plus de 20-30kb pour être cette pattate.  [...] donc à priori ces grosses bandes près des puits seraient de l'ADN Sinon j'ai un doute mais lorsque l'on mesure la DO à 260, on détecte ADN et ARN en même temps donc même en ayant un bon rapport (près de 1.8) ça ne signifie pas qu'il n'y pas de contaminant ADN Ce rapport permet de dire juste s'il y a ou non des protéines. C'est bien ça merci.  [...]

[Biologie Cellulaire] Triple transfection

Et en effet mettre le même nombre de plasmide est mieux que des quantités d'ADN arbitraire surtout si tes plasmides sont vraiment différents en taille. Veille aussi à ne pas dépasser la quantité maximale d'ADN à transfecter dans chaque puits (qui est la même que pour une transfection simple).  [...] Je considère que la manip est ratée quand je n'ai aucune preuve que mes cellules pulmonaires ont été infectées par le lentivirus (je le produis chez les HEK pour infecter des cellules pulmonaires). Les quelques premières fois, j'utilisais un système qui devait faire exprimer la GFP en même temps que ma protéine d'intérêt, mais aucune cellules pulmonaires ne semblait exprimer la GFP.  [...]

[Biologie Moléculaire] question sur la QPCR

Logiquement tu dois avoir une gamme d'étalonnage, c'est à dire des puits où ont été mis des quantités connue d'ADN d'intérêt. Grâce à ces puits, on peut tracer une droite reliant les Ct et les quantités d'ADN. Avec la taille du génome et le nombre d'Avogadro, tu peux calculer combien de cellules il a fallu lyser pour obtenir cette quantité d'ADN (ce qu'on appelle équivalent génome).  [...] A partir de 30, on considère souvent que l'amplification devient aspécifique. Par contre si ton négatif a un Ct proche d'un positif... aie. Là oui, il y a problème. Soit contamination d'un constituant de ton mix, soit mauvaise manip, tu as mis dans ton négatif l'ADN d'un autre puits. Qui pourrait alors servir de négatif.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel (qPCR)

the crossing points (qui nous montrent le nombre de cycles necessaires à chaque ADNc pour que sa courbe commence à augmenter). Ma question est de savoir comment procéder pour traiter ces résultats (the crossing points).   [...] selon le principe théorique de la PCR, la quantité d'ADN double à chaque cycle. Autrement dit, si entre 2 puits il y a une différence de Ct d'un cycle, on peut supposer qu'il y a 2X plus d'ADN dans un des puits.  [...]

[Biologie Moléculaire] Révélation des extraits d'ADN

je crois que je me suis trop précipitée avant de me poser des questions, les bandes bleues ont finalement révélées une fluorescence bien nette pour les premiers puits qui correspondaient à des ADN extraits avec un kit tout prêt.  [...] par contre la seconde série de puits correspondait à des ADN extraits à l'ancienne avec toute l'armada de solutions que j'avais eu tant de mal à préparer.  [...]