• Forum - Protocole, Digestion, Plasmide

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Voici brievement le protocole, digestion du plasmide par une enzyme qui génere des extrémités cohésives (pacI), puis purification des deux fragments à partir d'un gel d'agarose QIAEXII.  [...] C'est le protocole que j'ai suivit digestion du vecteur, purification du backbone (plasmide sans insert) et de l'insert (kit QIAEXII) j'ai ensuite déphosphorylé le plasmide.  [...]

calcul dilution plasmide

dans le protocole que j ai en nous demande de prendre 5ug du plasmide la concentration de mon plasmide quand je l ai verifier au nanodrop est de 43ng/ul.  [...] ou carrément reconcentre mon plasmide car sa donne 116ul et le volume final dans le protocole doit etre de 100ul donc c impossible.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai donc essayé de digéré mon plasmide ainsi que ma k7 de résistance (1 enzyme pour le vecteur mais 2 sites différents et 3 pour la k7 de resistance). Ce protocole n'a fonctionné qu'une fois. Depuis j'ai toujours des vecteurs ayant échappés à la quadruple digestion.  [...] J'ai testé plusieurs protocoles de digestion du plasmide et de l'insert (de 4h à O/N de digestion). Déphosphorylé ou non pour le vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

Si tu mets 1 unité d'enzyme et que la réaction fonctionne à 100%, tu auras 1microgramme de digéré. Je te conseille de mettre plutôt 2 unités avec 10 microlitres de ton plasmides (1,5mg), tu devrais avoir largement assez de matériel pour le clonage qui suit.  [...] Je me demandais si cette quantité de plasmide est donc suffisante pour ce que je veux faire (c'est la toute première fois que je fais un protocole de digestion ).  [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

Tu va passer d'une forme circulaire à une forme linéaire après digestion. On te demande donc de trouver les extrémités du plasmide.  [...] Tu digères un plasmide lorsque tu veux modifier ce dernier, y rajouter un fragment ou en retirer un. On passe avant tout par cette étape de digestion. Après tu as un étape de ligation si éventuellement tu veux recirculariser le plasmide après y avoir insérer un fragment entre XhoI et NcoI.  [...]

[Biologie Moléculaire] PB ADN dans le puit d'agarose

Après digestion, j'ai fais migrer mon plasmide coupé versus le non coupé et j'obtiens bien les 3 formes du plasmide non coupé, mais par contre mon plasmide coupé avec ApaI est resté dans le puit, j'ai refais la digestion est même chose.  [...] Alors quoi faire, je ne pense pas que ce soit la quantité d'ADN car j'ai refais le même protocole avec un autre vecteur et cela fonctionne.  [...]

Carte de restriction d'un plasmide

Question confuse. Dans un plasmide recombinant on a un vecteur et un insert. L'ADN génomique humain a une taille d'environ 3 000 000 000 Nt. Mais je suppose que c'est la taille de l'insert du plasmique recombinant que tu veux.  [...] Bonjour à tous j'ai également un problème au sujet d'un exercice sur les cartes de restriction j'ai mis le fichier en question, il s'agit de la fin de l'exercice 1 de ce TD ou il faut donner la carte de restriction du plasmide pk rec.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR colonie et PCR ADN

bête question. vous êtes sûrs que lors de la PCR sur colonie, il n'y a pas de milieu de ligation qui se ballade Genre il y aurait de la préparation contenant le plasmide, avec le plasmide contenant l'insert, qui flotte dans le milieu et donnerait un faux positif en PCR.  [...] Quand tu dis que le plasmide est présent seul dans la miniprep, sais tu si il est sous forme linéaire ou circularisé par la ligation. (Une digestion avec une seule enzyme devrait donner 2 fragments si il est linéaire). Imaginons que la ligation ne fasse que circulariser le plasmide sans introduire l'insert, ça pourrait conférer la résistance et la PCR positive proviendrait de l'insert qui est transformé en même temps.  [...]

TP sur les plasmides

Après une culture bactérienne on a trouvé qu'E. coli était responsable et plus particulièrement un plasmide afa-3, qui code pour l'adhésine (protéine qui est responsable de la diarrhée -en gros-).  [...] On a comme modèle de référence donc un plasmide de type afa-3 d'E. coli. On a fait une simulation de digestion de ce plasmide, ce qui nous a donné plusieurs fragments de plasmide.  [...]

Séquençage de l'ADN

S'il est obtenu par PCR, ou par digestion enzymatique (sauf blunt) par exemple, on sait dans quel sens il sera inséré dans le plasmide. Si on fait du séquençage total (comme WGS par ex), on s'en fout un peu puisqu'il y aura, après reconstitution, des séquences codantes sur les deux brins.  [...] S'il est obtenu par PCR, ou par digestion enzymatique (sauf blunt) par exemple, on sait dans quel sens il sera inséré dans le plasmide.  [...]