• Forum - Protéines, Stratégie, Clonage

[Biologie Moléculaire] stratégie de clonage.

Malgré mon cours d'ingénierie des protéines sur la stratégie de clonage,j'ai beaucoup de mal a me faire une idée claire de la méthode de clonage et de ses différentes étapes sur des adn eucaryotes.Est-ce que quelqu'un pourrait m'expliquer avec ses mots comment cela se passe en général pour des séquences connues,partiellement connues et inconnues.  [...] Merci quand même de m'avoir répondu, je reconnais que ma question est pas très claire mais c'est parce que j'ai un peu de mal a me faire un idée concrète du déroulement du clonage même si je pense avoir plus ou moins compris mon cours, je le relis de plus en plus et ca rentre de mieux en mieux.  [...]

PCR et clonage

1- soit tu mets des sites de clonages en 5' dans tes oligos qui vont te permettre d'amplifier le fragment par PCR. Ensuite tu digeres le produit de PCR avec ces enzymes et tu le ligue dans ton vecteur coupé par les enzymes compatibles.  [...] Ensuite je suis pas certain de l'avantage de cette strategie par rapport au clonage franc directe du produit de PCR... piwi tu pourrais expliciter les raisons qui font que tu as choisis une telle strategie plutot qu'un clonage plus simple.  [...]

[Biologie Moléculaire] identification d'un gène

Enoncé. Dans le cas d'une maladie génétique, il ya plusieurs gènes dans une région d'un chromosome X. Certains codent des protéines dont la fonction est connue. En admettant que le syndrome observé est due à l'altération d'un seul gène, quelles stratégies expérimentales faut il utiliser pour identifier ce gène.  [...] La stratégie que j'aurais proposé sans réfléchir trop, au pied levé quoi c'est de faire un vecteur avec le gène codant pour une protéine connue standardisée type GST (toute seule) et un autre vecteur avec un gène pour chacune des protéines susceptibles d'être en jeu fusionné avec le gène codant la GST.  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

La methode indiquée peut etre utilisée seulement quand tu cherches a cloner l'ADNc d'un gene connu (afin notament de le cloner sans ses introns), mais evidemment tu ne peux pas partir a la peche aux genes inconnus (sauf a utiliser des amorces dégénérées calculées a partir de regions hautement conservées dans les protéines de cette famille.  [...] Je n'arrive pas à comprendre la stratégie utilisée ni l'intérêt d'utiliser cette technique par rapport à un clonage classique. Quant aux subtilités de la démarche.  [...]

[Génétique] clonage orienté ou non

Concernant les différents types de clonages, celà dépend effectivement de la stratégie adopter pour le clonage via le choix des enzymes de restriction.  [...] Par contre, si on réalise un clonage ayant pour but d'exprimer une protéine, l'orientation de notre insert dans le plasmide d'expression sera primordial pour que le couplage transcription/traduction se réalise.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

J'ai besoin d'aide pour un clonage. Je dois cloner un fragment d'ADN génomique bactérien dans un plasmide. La stratégie choisie est de linéariser le vecteur par digestion enzymatique, de le purifier sur gel, de le déphosphoryler et de faire la ligation avec l'insert.  [...] Et je bloque à cette étape. j'obtiens autant de clones pour mes bactéries transformées par le vecteur linéarisé que par celles transformées par le plasmide natif. J'en ai donc déduit une mauvaise digestion. Or, j'utilise les enzymes Fast Digest de chez Fermentas pour une digestion o/n.   [...]

Guérir de la peste.

en fait il y a un gouffre entre comprendre comment un virus ou une bactérie est pathogène, par exemple, puis identifier toutes les protéines impliquées, et enfin envisager une stratégie pour développer un médicament.  [...] Mais c'est d'autant plus inimaginable dans le cas du vaccin par exemple. En théorie, à partir de séquences, on déduit des protéines, des structures tridimensionnelles, mais on est très loin de pouvoir utiliser ces infos pour prédire une interaction hote pathogène et envisager de la moduler. C'était plus ça le concept dont je parlais.  [...]

[Biologie Moléculaire] Projet de clonage

ce trimestre on fait un projet de clonage du gen-gfp dans pcDNA3.1 et calculer l expression du transgene le gfp gen doit etre apres le CMV promoteur. on doit faire une strategie de clonage ( on est a 7 en groupe) chaqu un doit pense a une strategie et apres on va comparer les resultats.  [...] La stratégie globale est bonne mais comme on te l'a déjà dit plus haut, tu dois choisir des sites de restrictions compatibles pour que la ligation fonctionne.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

Cela ne règlera pas ton problème, mais ça pourrait contribuer à le résoudre. Je n'ai pas compris grand chose à ta stratégie de clonage, surtout parce-que tu n'as joint aucun schéma (carte du vecteur par exemple).  [...] Votre approche est interessant mais pas applicable dans mon cas. L'intérêt de la k7 de resistance de 2000 pb est un témoin de digestion du phagemid. Dans votre stratégie, au lieu de purifié un produit de digestion, je puriferais sur gel un produit PCR. Je garde cela en tete mais je doute.  [...]

[Génétique] Production d'interleukine 2

Il faudrait déjà que tu choisisses ton système de production (eucaryote me parait le mieux..), que tu choisisses ton vecteur (un plasmide me parait pas mal, avec un tag pour la purification), que tu trouves la séquence cDNA de l'IL2 (sequence CDS sur pubmed), que tu définisse ta stratégie de clonage (les bonnes enzymes de restriction en fonction de ton plasmide et de ton insert), tu fais une ligation, puis une transformation en bactérie.  [...] N'as tu pas la possibilité de produire en eukaryotes (HEK293 par exemple). Entre la maturation des protéines et les corps d'inclusions j'ai peur que tu sois limitée chez e.coli.  [...]