• Forum - Protéines, Plaque, Puits

[Biotechnologie] Culture bactérienne et protéines recombinantes en plaque 96 puits

Mon problème est le suivant, si je fais des test d'expression en format plaque 96 puits, comment séparer la fraction soluble et insoluble après la lyse bactérienne...car je ne possède pas de centri/rotor permettant de faire tourne une plaque 96 puits à une telle vitesse (15000g).  [...] Concernant le rotor, je me suis renseigné...avec l'équipement présent au labo, je peux mettre un rotor pour la centri des plaques qui monte à une vitesse max de 6500g...a priori pas suffisant.  [...]

lyse des cardiomyocytes par tampon de lyse et dilution du lysat cellulaire en protéine

J'ai lysé mes cardiomyocytes par le tampon de Karla j'ai mis 1ml par puits d'un plaque de 6 puits mais proteinés sont diluées dans le tampon de lyse je ne sais pas comment les concentré.  [...] Avez-vous testé l'absence de peptides Il se peut aussi que la lyse ne soit pas effectuée correctement/complètement, ce qui limiterait fortement la diffusion des constituants du cytosol.   [...]

[Biotechnologie] Pb profiles electrophoretiques de proteines decales

Je travaille actuellement sur un appareil utilisant un systeme de plaque avec puits (10 puits pour echantillon et un puit pour le ladder) pour realiser des migrations de proteines (hordeine).  [...] la tension a la meme valeur entre les 2 labos.. Ce sont des petites electrodes qui viennent tremper dans chaque puit et qui apportent une certaine tension pour la migration des proteines dans les canaux de la plaque.  [...]

[Biotechnologie] méthode de Bradford

J'ai une toute petite question sur le principe de cette méthode. Lorsqu'on veut par exemple quantifier les protéines d'une solution à l'aide d'une gamme de sérumalbumine bovine prédéfinie. Où met on le Bradford est ce qu'il est sur toute la plaque de micotitration ou bien il doit être mélanger dans chaque puits avec le sérum albumine et notre solution à titrer.  [...] Par contre je ne sais toujours quelle quantité de Bradford (ou bleu de coomassie) mettre dans mes puits rien n'est indiqué dans mon protocole à part de diluer le bradford au 1/5ème... Je suppose qu'on en met que quelques gouttes.  [...]

[Immunologie] ELISA coating et conservation

Je dilue 1 000 fois mon anticorps avant utilisation, je mets 200 µL dans chaque puits, j'incube (selon le moment où je veux récupérer les plaques) soit 3h à 37 °C, soit 4h à 27 °C, soit toute la nuit au frigo (4 °C).  [...] Pour la saturation c'est l'étape la plus importante de ton ELISA. Le principe du coating, c'est que tes protéines (Ac ou Ag) s'adsorbent sur le plastique du puits par des interractions hydrophobes. De ce fait si tu ne sature pas l'espace restant sur le plastique entre tes protéines de coating, le risque c'est que les Ac que tu ajoutes après eux s'adsorbent et du coup faussent tes résultats.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème culture cellulaire HEK293 en plaque 96 puits

Je travaille actuellement avec des HEK293 que j'ai repiquées en plaque 96 puits dans le but de faire un MTS. 24h après le repiquage (~10000 cellules/puits), mes cellules apparaissent adhérentes, belles et bien éparpillées dans le puits mais peu confluentes (20% grand max).  [...] La seule solution potable que j'ai trouvé c'est d'incliner ma plaque 96p à l'opposé de moi (donc vers le fond de ma hotte) et de poser les tips inclinés le long de la paroi des puits (le haut de la pipette étant orienté vers le fond de la hotte). Et surtout de déposer ma solution très très très très doucement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Migration SDS page en "sourire"

si tu as des puits en rab de chaque coté, dépose du tampon sans protéines (genre laemmli dilué comme si il y avait des protéines) dans chacun des puits libres de chaque coté. Idéalement, il faut centrer les dépots et combler les puits vides de chaque coté.  [...] 2) Si on laisse des puits inoccupés par un échantillon, les protéines des puits adjacents peuvent mal migrer, c''est ce qu'on appelle 'l'effet de bordure. Ce problème est facilement réglé en mettant simplement du tampon d'échantillon (1 X) dans ces puits inutilisés.  [...]

[Biologie Cellulaire] Calcul culture cellulaire

Bonjour je me suis mise récemment à la culture cellulaire ainsi qu'à la transfection et j'ai beaucoup de mal avec les dilutions. En gros j'utilise le compteur de cellules. Si par exemple il me donne une concentration de 1.480.000 cel/ml (sachant que le culot a été repris dans 10ml de milieu) comment devrais je effectuer la dilution sachant que pour la transfection j'ai besoin de 125.   [...] 000 cellules par puits ( pour un puits donné je dois mettre 1.5 ml de suspension cellulaire et j'utilise au total un plaque de 6 puits).  [...]

[Biologie Cellulaire] co-culture les cellules vont-elles interagirent??

Sur une mono-couche de cellules stromales adhérente et à 80% confluente (dans une plaque 6 puits) nous aimerions co-cultiver pendant 3 jours, des cellules B immatures appelé cellules transitionnelles.  [...] Par contre j'avais pensé à centrifuger légèrement la plaque 6 puits pour faire tomber les cellules transitionnelles au fond et favoriser la rencontre avec les cellules stromales. Cependant j'ai peur qu'au début et à la fin de la centrifugation mon milieu ne s'échappe des puits...Qu'en pensez-vous.  [...]

[Biologie Cellulaire] Nombre de cellules

On peut utiliser des marquages de noyaux (DAPI) puis compter le nombre de spot lumineux, mais quelles sont les autres alternatives.   [...] Certains commerciaux proposent des microscopes avec des logiciels d'analyse pour remplir cette fonction. De mémoire, tu peux faire une coloration au Tryptan Blue (les cellules vivantes excluent le bleu) ou même pas de coloration du tout (dans ton cas, sur cellules fixées par exemple).   [...]