• Forum - Protéines, Interactions, IP

[Biologie Moléculaire] Immunoprécipitation

Si j'IP une protéine X, et que je fais tombé une protéine Z, cela veux dire que ces protéines sont en interactions direct ou indirect non.  [...] Pour ensuite verifier une interaction direct, je fais un double hybride.  [...]

[Biochimie] extraction protéines membranaires à partir de tissu cérébral congelé (pour étude de co-IPP)

Pour effectuer une co-IP sur des protéines membranaires, je pense qu'il vaut mieux opter pour un détergent doux. Le CHAPS est souvent utiliser pour les co-IP car il est très doux. Un détergent trop fort dénature les protéines et les interactions entre les protéines sont très sensibles à la structure 3D.  [...] J'ai trouvé ce détergent. N-dodecyl-ß-D-maltoside, savez-vous s'il conserve les interactions entre deux prot membranaires (récepteur canal + protéine régulatrice) Car j'ai malheureusement lu que le CHAPS casse les interactions entre les protéines membranaires, donc ce n'est pas bon pour moi ( Useful for solubilizing membrane proteins and breaking protein-protein interactions ).  [...]

[Biochimie] dot plot et overlay

Dans le but d'étudier les interactions entre 2 protéines, je voudrais faire un dot plot pour immobiliser ma première protéine sur la membrane de nitrocellulose, par la suite je voudrais faire un overlay ou j'incube ma membrane de nitrocellulose dans la solution de la deuxième protéine et je révèle les interactions par l'anticorps de la deuxième protéine.  [...] En faite, comme j'en ai que peu des deux protéines je suis obligée de commencer par le dot plot et l'overlay pour voir les interactions possibles et par la suite je passerai a l'IP. J'ignore la quantité exacte de protéines que je dois déposer.  [...]

[Biochimie] Etude des partenaires protéiques : Co-Immunoprécipitation, Tap-Tag et double hybride

Et je me posais la question de savoir quel type d'anticorps fallait-il utiliser pour la Co-Ip Un anticorps poly ou monoclonal Si j'utilise un anticorps polyclonal, il risque de se fixer un peu partout sur ma protéine et je risque d'empêcher les interactions.  [...] Pour l'IP, ça dépend des protéines il n'y a pas de règle absolue, mais il est vrai qu'n monoclonal peut masquer un potentiel site d'interaction avec une autre protéine.  [...]

[Immunologie] immunoprécipitation

L'immunoprécipitation est une technique biochimique permettant de mettre en évidence une intéraction physique entre 2 protéines. On effectue d'abord une IP avec une résine permettant de purifier uniquement une protéine et ensuite on révèle par western la seconde protéine qui, si elle est présente, démontre bien que les 2 protéines étaient liées car l'IP ne sélectionne que la première protéine ou la première protéine plus celles qui sont liées à elles de manière covalente.  [...] Ben non car il y a toujours une part d'aspecifique dans ces reactions. donc tu vas avoir plus ou moins de proteines contaminantes qui vont etre purifiées avec ta proteine d'interet. Le SDS-PAGE te permet de verifier que la taille de la proteine immunoprecipité est bien la bonne.  [...]

[Biologie Moléculaire] Dégradation de la cycline D1

Une autre approche est d'effectuer une IP anti-cycline D dans des conditions où tu conserve les interactions protéine-protéine. Ensuite tu cribles en spectro de masse les partenaires protéiques de la cycline D1 contre une banque de données à la recherche de séquences correspondant à des ubiquitine ligases.  [...] On peut ainsi voir toutes les protéines qui interagissent avec la cycline D. Si une ubiquitine ligase interagit avec la cycline D dans les conditions où on a effectué l'IP, alors un des spectre de masse obtenu correspondra avec le spectre de masse d'une ubiquitine ligase de la banque de données.  [...]

[Biologie Moléculaire] Co-IP : protéines qui se coat sur les billes :(

Voilà en ce moment je suis en train de faire des Co-IP in vitro pour montrer l'interaction (si c'est le cas) entre 2 protéines purifiées.  [...] Je soupconne être confronté à une forte interaction spécifique qui diminue grandement ma quantité de protéine et je pense que je vais essayer de saturer les billes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Phosphorylation sur tyrosine => dégradation par protéasome???

Alors en fait cette protéine est bien ubiquitinylé (.) par des complexes qui reconnaissent des sérines phosphorylées sur cette protéine. Pour ce qui est du MG-132 je n'ai pas encore fait le test. sinon pour ce qui est de la compétition d'expression j'ai fait un contrôle de transfection en cotransfectant le plasmide de la protéine X avec le vecteur d'expression vide de la protéine Y et de plus lorsque je cotransfecte le plasmide de ma prot X avec le plasmide de la kinase Y inactive j'ai l'effet inverse c'est à dire une accumulation d'X.  [...] Si tu veux montrer l'intéraction de 2 protéines tu peux faire du Y2H mais les reviewers vont te demander une co-IP pour confirmer, et du siRNA comme tu l'as évoqué. c'est le même principe.  [...]

[Biochimie] analyse résultat d'IP

Je ne comprends pas dans les figures B et C (respectivement immunoprécipitation et pulldown) à quoi correspond les colonnes 1/10 input Dilution au 1/10e mais de quoi Pourquoi les bandes sont plus épaisses.   [...] Input, c'est le western effectué sur l'extrait avant IP. Il contient donc toutes les protéines et sert a vérifier que dans ton extrait, la protéine dont tu étudies l'interaction avec ta cible de précipitation est bien présente.  [...]

Problème de biologie moléculaire

C'est quand même assez étrange de donner ce genre d'exercice en 2016. Désormais quand on connait le gène en question, on commence par une analyse bioinfo pour déterminer la famille de protéines à laquelle elle appartient, si il y a des motifs d'interaction à l'ADN, ou à l'ARN.  [...] déjà voir si la séquence ressemble a quelque chose de connu (il n'y a pas 1000 façons pour une protéine de se lier à l'ADN, et ça on peut le reconnaitre), si elle a des domaines d'interaction avec des protéines connues, et pour compléter, IP, dépôt des protéines sur gel et analyse spectro de masse (en qq jours vous pouvez connaitre toutes les protéines qui interagissent avec votre cible) et/ou Chip-seq (ça reste un peu délicat et cher mais ça ratisse large et c'est très informatif).  [...]