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[Biologie Moléculaire] Eléctrophorèse

Le PAGE SDS dénature les protéines en rompant les liaisons hydrogène, donc si on obtient deux bandes à 50000 et 30000 cela signifie que la protéine est multimérique et contient au moins 2 sous-unités de ce poids moléculaire là.  [...] Et j'imagine que la raison pour laquelle 50000+30000 n'est pas égal à 160000 est qu'elle est en fait constituée de plusieurs chaines protéiques de cette masse là.  [...]

Biochimie Sds

Voilà, dans un exo, on étudie une protéine par gel filtration dans un tampon aqueux à pH=7 qui présente un poids moléculaire apparent de 160 000 daltons.On soumet cette protéine à une électrophorèse sur gel en présence de SDS.La révélation montre 2 bandes correspondant à des poids moléculaires apparents de 50 000 et 30 000.  [...] Il y a fort à parier que la protéine native compte 2 grosses sous unités (50 kDa) et 2 petites sous-unités (30 kDa) pour un total de 160 kDa.  [...]

Migration SDS PAGE

Le problème viens de la migration (200Volt constant, ampérage se régule seul), qui est réalisée en tampon MES (50mM mES, 50mM Tris Base, 0.1% SDS et 1mM EDTA), la migration du gel se passe bien, la séparation du poids de marqueur moléculaire est jolie et bien distincte, mais après coloration au bleu de coomassie (1H sous agitation), et décoloration à l'eau tiède.  [...] Je suis ce protocole depuis toujours pour la migration des gels en tampon MOPS (protéine standard), et je n'ai aucun soucis. Le fait de passer en tampon MES (protéine de faible poids) me donne des gels illisibles.  [...]

HPLC en proteomique

J'ai une solution contenant environ 70 mg de protéine, base sur une estimation que j'ai effectuée après visualisation sur SDS-PGE. La protéine est diluée dans un tampon Tris à pH 8.0 et son pI est de 6.1. J'ai à ma disposition une colonne Hitrap Q HP de 1 ml et un collecteur de fraction.  [...] Je purifie donc ma protéine sur une colonne en utilisant du Tris à pH 8.0 comme tampon de chargement. Après avoir déposé mes fractions sur gel SDS-PAGE, je peux voir la protéine au bon poids moléculaire dans les fractions 10-12, ce qui correspond à 400-500mM de NaCl.  [...]

[Biochimie] Western blot

oui effectivement je pense que tu peux jouer sur le temps et tenter un transfert sur toute une nuit. Les grosses protéines transfèrent mal.  [...] Cependant une personne de mon équipe a réalisé un transfert d'une très grosse protéine (. 300 kDa) et il a un tampon de transfert adapté, pris d'une publie. Il réalise son transfert à 20V à 4°C et a noté une nette amélioration du transfert des marqueurs de haut poids moléculaire comparé aux méthodes classiques.  [...]

[Biochimie] Casser des aggrégats

Mes cellules surexpriment en effet ma protéine, je travaille sur des cellules BHK et j'utilise le tampon RIPA comme tampon de lyse.  [...] D'habitude, une fois le tampon de Laemmli ajouté, je dénature 1h à T° ambiante pour cette protéine. Et les résultats en western sont très satisfaisants, une belle bande.  [...]

dégradation de protéine recombinante

Si ta protéine ne s'aggrège pas dans un tampon A contenant 20 mM de tris et rien d'autre (ou de n'importe quoi d'autre pour stabiliser le pH), c'est l'ideal.  [...] Si tu fais une echangeuse d'ions, ça ressemble beaucoup plus dans le principe à une colonne de Ni. C'est un peu plus compliqué à mettre au point, mais ça sépare souvent plus efficacement quand on sait s'en servir. Dans ce cas, tu fais circuler le même tampon A avec la protéine.  [...]

[Biochimie] Tampon de purification, NaCl et KCl

La protéine étant plus stable dans le PO4 (que dans le Tris), je suis passé à un tampon K2HPO4 / KH2PO4. Pour éviter d'introduire trop d'ions différents, je voudrais utiliser du KCl à la place du NaCl. Je constate que dans la littérature, il est fréquent que celui-ci soit utilisé à des concentrations moindres, mais je ne trouve la raison nulle part.  [...] Ma question est donc. pourquoi la concentration de KCl dans un tampon est toujours plus faible que le NaCl Le KCl stabiliserait la protéine plus efficacement, et éviterait les interactions non spécifiques à concentration plus basse.  [...]

[Biochimie] purification proteines

Voila j'ai une question qui m'est venue à l'esprit. pourquoi utilise t-on du beta-mercaptoethanol dans le tampon d'elution d'une proteine et dans le tampon de dialyse. Je pensais que le beta-mercaptoethanol etait une reducteur qui denaturait la proteine donc à la fin de la purif la proteine devrait donc être inactive.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunoprécipitation

Je fais mes IP sur 1,5mg par échantillon (ma protéine n'étant pas trés abondante) donc environ 7 millions de celllules par puit lors du WB. Cela dit après avoir lysé mes cellules (tampon salin ou NP-40 pendant 30 min) je centrifuge le lysat et ne fait mon IP que sur le surnageant.  [...] Normalement avec les ultra centrifugations dans un tampon salin la protéine devrait se détacher. La question n'est normalement pas là.  [...]