• Forum - Protéine, Intérêt, Activité, Enzyme

[Biologie Cellulaire] Séquence nucléotidique des protéines.

Merci pour la reposes cest bien ce que je supposais. Ça me rassure. Ainsi que pensez vous alors de la citation On raboute a la séquence de nucléotide d'une protéine dite rapporteur. Une enzyme.  [...] L'idée peut être ici de suivre l'expression protéique de la protéine d'intérêt en suivant l'activité de l'enzyme rapportrice.  [...]

[Biochimie] Activité enzymatique

Je cherche à doser l'activité d'une enzyme impliquer dans l'amylolyse. Je travaille sur des bouilles de farine que je resuspend dans du sérum physiologique. J'ai besoin de centrifuger à 10 000g et je me demande si je ne précipite pas mon enzyme d'intérêt. Comme je n'ai aucune expérience en protéine/enzymo je sollicite votre aide.  [...] Ca me rassure si les protéines ne précipite pas dans du sérum physiologique, c'est déja une très bon point à vrai dire. Par contre il est quasiment impossible de solubiliser le culot et même de le pipetter(c'est de l'amidon bien pateux style maizena en plus compacte) a moins de chauffer fortement, ce qui a mon avis va alterer l'activité enzymatique.  [...]

Immunoblot

C'est tout à fait ça. Et pour le western, on détecte les protéines avec un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, cet anticorps lui-même porteur d'une activité détectable (fluorescence, activité enzymatique, radioactivité). C'est donc une variante du SDS-PAGE, car c'est toujours une électrophorèse de protéines sauf qu'on n'est pas en conditions dénaturantes et qu'on détecte avec un anticorps.  [...] Et pour le western, on détecte les protéines avec un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, cet anticorps lui-même porteur d'une activité détectable (fluorescence, activité enzymatique, radioactivité).  [...]

[biochimie] activité spécifique/activité totale

Bonjour, c'est la première fois que je me sers de ce forum et je ne comprend absolument pas comment créer ma propre question ^^.   [...] Dans mon cours il est dit que l'activité totale évalue la quantité de protéine d'intérêt dans le milieu et que l'activité spécifique évalue la quantité relative de protéine d'intérêt dans le milieu.  [...]

[Biochimie] dosage enzyme pour quoi utiliser le bain-marie ?

Je pense que pour la préparation du tissu dans le tampon, on dit qu'il faut travailler dans la glace 4C°,c'est pour inactiver l'enzyme(par le froid) et éviter l'augmentation de la température du tissu lors du broyage et de ce fait éviter la dénaturation de l'enzyme, car une enzyme soumise a basse température est inactivé mais elle n'est pas dénaturée (et qui est donc de ce fait détruite comme dans le cas d'une haute température).  [...] Soit on veut empêcher que l'enzyme soit active durant la phase de préparation (car ainsi il n'y a aucun produit de formé, toute l'activité que tu verras par augmentation de l'absorbance sera du à des réaction se produisant à ce moment là), soit il y a d'autres enzymes ou inhibiteurs de ton enzyme dans l'échantillon qui pourrait dégrader ton enzyme d'intérêt.  [...]

[Biochimie] Rendement et facteur de purification

si tu veux, l'activité spécifique désignant la quantité d'enzyme quil faut pour une activité totale tant, en la purifiant, tu enleves les résidus pesant dans la protéine, donc je suppose que en purifiant, tu as augmenté son activité spécifique, donc le facteur de purification désigne le gain que tu as eu en efficacité.  [...] Normalement, il y a notre protéine d'intéret A + pleins d'autres protéines dans l'extrait initial. On a donc une activité totale x dans cet extrait qui est proportionnelle à la quantité de A dans l'extrait.  [...]

[Biochimie] Dégradation tag et protéase

Que voulez faire exactement Si c'est pour éliminer le tag, plusieurs options existent déjà telles qu'intercaller un site de coupure pour une enzyme spécifique entre le tag et la protéine d'intérêt.  [...] Le but de cette partie du projet, c'est d'avoir une activité protéase sur demande dans un organisme. Je pensais faire une protéine de fusion avec une partie de la protéase fusionnée au phytochrome, et l'autre partie fusionnée à PIF3, une protéine qui se fixe au phytochrome une fois activé par la lumière rouge.  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

La méthode que Delirium m'a gentiement indiqué permet directement une sélection spécifique de l'Adnc avant clonage puisqu'on utilise des amorces spécifiques lors de l'amplification mais la sélection des clones d'intérêt au sein d'une banque d'adn na se fait-elle pas ensuite (une fois la banque construite) par criblage (hybridation avec une sonde specifique) où bien quel est l'intérêt de la banque.  [...] Beh, tu introduis dans des bactéries pour obtenir une quantité de plasmides élevée et puis tu extraies cet ADN. Mais le truc est que ta banque n'est pas les cellules, ta banque est toutes les copies des fragments d'intérêt que tu souhaites (représenté chacun une 10aine de fois, je crois, pour être certain que tout le génome est couvert).  [...]

[Biologie Cellulaire] Fusion transcriptionnelle et traductionnelle

Après traduction tu auras ta protéine d'intérêt (celle codée par la séquence codante 1) + une protéine codée par un gène rapporteur, comme la GFP.  [...] Maintenant si tu veux non plus localiser une protéine d'intérêt mais quantifier l'activité d'un promoteur donné entre plusieurs conditions, tu peux construire quelque chose comme [promoteur d'un gène d'intérêt]-[5'UTR]-ATG-séquence codante d'un gène rapporteur-STOP-[3'UTR et terminateur de transcription].  [...]

[Biologie Cellulaire] Anticorp anti-espece et Western Blot

L'anticorps secondaire (que tu as nommé AC2) est celui qui va te permettre de mettre en évidence la réaction AC1-protéine d'intérêt. cet anticorps (AC2) sera couplé à une molécule qui permettra la révélation (en général l'enzyme HRP, peroxydase de raifort).  [...] Cet anticorps sera lui dirigé contre l'anticorps primaire, c'est un Ac anti AC1. Par conséquent dans l'exemple, si tu as utilisé un anticorps de souris comme AC1, l'AC2 sera un anticrops anti anti-corps de souris, produit par exemple chez le lapin. le couple AC1-AC2 n'est pas produit dans la même espèce animale, puisque l'AC2 est censé reconnaire l'AC1 comme un antigène.   [...]