• Forum - Protéine, Expression, Méthanol

[Biotechnologie] Bloquer l'expression d'un gène chez la levure

je veux induire l'expression de ma proteine chez la levure pichia normalement cette proteine doit etre excreté hors de la levure.j'ai fait un preculture dans le BMGY et apres dans le BMMH( 0.5% methanol) à 30°c.  [...] j'ai pas une explication et meme pas une idée pour induire l'expression de ma proteine et la produie vers l'exterieu de la levure.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gène0 AOX1!!

L'expression du gène AOX1 ne se fait qu'en présence de méthanol et seulement celui ci, ainsi le gène AOX1 a été isolé, son promoteur a été introduit dans des vecteurs pour diriger l'expression du gène codant pour la protéine désirée.  [...] Ce qu'il faut comprendre est plus simple. Le promoteur est inductible par le méthanol. On isole et on clone ce promoteur, on met la séquence codante que l'on veut derrière. Du coup, on crée une protéine dont l'expression est inductible par le méthanol.  [...]

[Génétique] Adn

voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une menbrane pour un test de type western. sachant ke la formulation de ce tampn est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( ja i reponde a la kestion) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...] voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une membrane pour un test de type western. sachant que la formulation de ce tampon est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( j'ai deja repondu a cette question) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...]

Différence de fixation des cellules

Bien souvent les différences de résultats entre les modes de fixation dépendent de l'anticorps utilisé et de la protéine visualisée. Certains Ab ne donnent aucun résultat en méthanol et s'utilisent exclusivement en PAF alors que pour d'autres c'est l'inverse.  [...] Avec le methanol, la fixation s'effectue par deshydradation (denaturation des proteines) alors qu'avec les aldehydes (formaldehyde, glutaraldehyde) on conserve la structure 3D de la proteine (fixation par pontage). Donc effectivement, si tu utilises un anticorps conformationnel, la detection de ton antigene sera impossible apres une fixation en methanol.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème immunofluo

quelqu'un aurait de l'expérience en IF voici mon problème. j'ai jusqu'à présent travaillé avec des cellules vivantes en fusion GFP. Désormais je dois faire des IF sur cellules fixées. Pas de problèmes pour un marquage de la tubuline (avec des anticorps) ou pour un marquage actine (avec de la phalloidine), mais pas moyen d'avoir un signal avec ma protéine d'intérêt.  [...] fixation à la PFA, je n'utilise pas de méthanol étant donné que ma protéine pourrait avoir un lien avec le cytosquelette et il me semble que la fixation méthanol n'est pas top pour le cytosquelette... j'ai testé avec ou sans permeabilisation avec du triton, blocage lait ou blocage serum ou pas de blocage.  [...]

[Biochimie] Dosage de protéines par Bradford

J'ai effectué le dosage de protéine du lait. Pour l'extraction des protéines, j'ai peser 4g de l'échantillon et ajouter 20 mL de méthanol. Après centrifugation le volume extrait de surnageant est de 21 mL avec une absorbance de 0.050 nm. La courbe d'étalonnage du BSA en fonction de l'absorbance est. y= 0.0078x.  [...] Non, je répète. vous aviez 4 g d'échantillon dans vos 21 mL, au final vous avez 6.4 µg protéine BSA dans 100µL qui représente 0,019 g donc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Nettoyage d'ARNs & Transfert de protéines

Pour le transfert de ta protéine, fait le 2H à 100 V (en utilisant un bain de glace bien sûr). Sinon garde le même voltage mais laisse plus longtemps. Je n'utilise pas le PVFD alors moi je transfert avec de l'éthanol qui me donne de meilleurs résultats mais toi tu es obligée de prendre le méthanol.  [...] Fanou, je me demande vraiment si tu fais une économie de temps en extrayant les protéines en même temps. Je pense par contre que c'est interessant pour comparer la réponse expression génique et synthèse des protéines correspondante surtout si tu travaille sur des échantillons de petite taille, ou très hétérogène.  [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

En plus, il contient le promoteur des génes OX1 et OX2 qui codent pour les enzymes (alcool oxydase) qui permettent de metaboliser les methanol (source d'energie et de carbone essentiel à cette levure).  [...] En gros, moi je fais le sous clonage dans top 10 pour amplifier le plamside recombinat PICZ-P30 pour pouvoir aprés l'introduire dans la levure pichia pastoris et le faire exprimer en induisant l'expression par l'ajout du methanol ds le milieu de culture.  [...]

Fermentation eau de Vie raté ?

Je n'ai pas de recette et je ne sais pas combien de temps il faut aux levures pour transformer tout le sucre en alcool ni à partir de quand l'acide acétique commence à être un problème dans la Fermentation, par contre je te met en garde contre le Méthanol, une production raté contient un taux de Méthanol élevé, une consommation excessive de ce genre d'alcool peu vous faire perdre la vue.  [...] une production raté contient un taux de Méthanol élevé, une consommation excessive de ce genre d'alcool peu vous faire perdre la vue.  [...]

[Biochimie] migration sds page

Je te conseille de transférer sur des membranes de PVDF préalablement mouillée dans du méthanol. La capacité de charge en protèïnes est plus importante (le double de la nitrocellulose).  [...] Ainsi tu peux visualiser tes protéïnes sur la membrane juste en la retrempant dans le méthanol puis en transilluminant. Tu verras peut-être tes bas poids molec apparaître.  [...]