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Recherche de références d'un anticorps anti FAS HUMAIN

Recherche de références d'un anticorps anti FAS HUMAIN.   [...] Je dois faire un western blot de la protéine FAS à partir d'échantillons provenant des cellules HepG2. Quelqu'un aurait-il des références d'anticorps qui marchent bien.  [...]

[Biochimie] Casser des aggrégats

Je travail sur des cellules eucaryotes, après avoir fait une extraction protéique, j'ai dénaturé certains de mes échantillons à 95°C, le souci est que j'ai inversé les tubes et la protéine que je veux voir forme des aggrégats lorsqu'on la dénature à 95°C.  [...] C'est pour cela que je pense que si je charge mes échantillons, cela me donnera un paté, et que je voudrais casser ces petits aggrégats, pour pouvoir charger mon gel.  [...]

[Biologie Moléculaire] mes échantillons avec le laemmli se transforment en gel !

Pour un western blot je prépare mes échantillons (des surnageants de cellules pour une production de protéine recombinante) dans du laemmli (Tris, SDS, glycérol, bromophenol blue, ß-mercaptoethanol). Jusque là tous va bien, mais après l'étape à 95°C je me retrouve avec une sorte de gel compact dans mon tube.  [...] Vous avez simplement beaucoup de materiel au départ. Si vous pouvez travailler avec moins (exemple. faire de simples WB) vous reglerez votre problème. Sinon (exemple. purif de protéines) il faut simplement soniquer pour fluidifer l'extrait.  [...]

[Biochimie] Action du formol dans la conservation

le formol, ou formaldehyde, va fixer, au sens littéral du terme les cellules, ou plutot leurs constituants. Il sert à faire des ponts chimiques entre les protéines (aussi bien de structure que les enzymes), protéines/ADN, bloquant ainsi tout le fonctionnement des cellules.  [...] Lors d'expériences in vitro, sur des lysats cellules fixées au formaldehyde, pour obtenir un pontage ADN-protéines, apres purification des protéines, la fixation est réversée en chauffant les echantillons 5h (ou O/N) à 65°C.  [...]

[Biotechnologie] cytométrie de flux/épifluorescence

la cytometrie de flux est une technique qui permet de détecter la taille, la granulosité d'une cellule ainsi que la fluorescence de protéines cellulaires (protéines fluorescentes comme la GFP ou marquées avec un anticorps couplé à un fluorochrome) ou de l'ADN (ex intercalant fluorescent de l'ADN).  [...] Un microscope à épifluorescence est un microscope muni de faisseaux laser, qui permet l'observation d'échantillons tels que des cellules possédant des protéines fluorescentes comme la GFP ou marquées avec un anticorps couplé à un fluorochrome.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western et révélation bandes

Le but de ce western est de localisé la ferroportine en comparant deux gels polyacrylamide. La migration de chaque échantillon étant réalisée dans 1 cas avec des protéines extraites de cellules non traités et dans l'autres cas avec des échantillons traités à l'hepcidine.  [...] la structure et la séquence de la protéine est détaillée, tout en bas vous avez des infos physico-chimiques dans la case peptide stats.  [...]

[Biochimie] Pb échantillon gel Tris-Tricine

Je travaille sur un peptide inférieur à 3 KDa et je voulais le visualiser en western blot. Mais je rencontre un petit problème. lors de la migration en gel tris-tricine, mes échantillons se reserrent )( dans mon gel de séparation. Pb de sels Mes échantillons sont préparés avec des cellules fraîches et broyées directement dans le tampon d'échantillon.  [...] Rq. une migration test pour le même type de gel (mêmes réactifs) a fonctionné avec d'autres échantillons (culots secs congelés d'autres cellules).  [...]

Cellules souches

Je te place ici quelques protocoles qui explique comment obtenir avec un FACS les cellules souches (notée SP sur la page 6/7 du site suivant) http.//liver-hsc.scgap.org/Protocols...t_protocol.pdf Comme tu peux le voir, il s'agit d'une très faible population (même si ici la population utilisée était d'origine sanguine).  [...] Au final, s'il utilise le choix, il faut s'assurer que l'ensemble des cellules de son échantillons sont dépourvues de ce marqueur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot difficile d'une protéine de réparation de l'ADN

Suite à quelques problèmes (impossible de mettre en évidence ladite protéine), j'ai décidé d'inclure une étape de sonication pour découper l'ADN des échantillons cellulaires.  [...] 1/ Après récolte des échantillons cellulaires, effectuer 2 lavages des culots au PBS 1X contenant 1 mM de PMSF et 0,5 µg/mL des inhibiteurs de protéases suivants. aprotinine, antipain et leupeptine ( l e tout glacial ) entrecoupés de centrifugation 800 x g /2 minutes/4°C.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Le mieux ce serait de faire migrer la protéine recombinante, si vous l'avez. Ou alors, une protéine de poids moléculaire avoisinant. Pour les gels commerciaux, le gradient 4-20% peut éventuellement être une solution. Vous pouvez demander des échantillons gratuits à un fournisseur bien connu, et faire migrer dans votre appareillage sans avoir à investir en plus dans un autre système.  [...] Certaines protéines notamment les plus grosses et les membranaires restaient alors piégées, elles restaient donc tout en haut du gel (dans le gel de concentration) et le WB était donc systématiquement négatif. Si tu es dans cette situation,tes échantillons doivent être fortement turbides et par ailleurs ils doivent extrêmement visqueux voire carrément pateux et le chargement doit être particulièrement difficile.  [...]