• Forum - Produit, Vecteur, Expression, Bactéries

[Biologie Moléculaire] démarches expermentales

- clonage du produit de PCR grâce a un vecteur d'expression dans des bactéries contrepentes.  [...] mais je ne sais pas quoi proposer après comme expérience après le clonage tjr pour mettre en évidence la mutation attendue dans le gene X.   [...]

clonage

donc je suis vraiment dzl de vs déranger mais je veux juste savoir prk passé par le clonage dans des bactéries alors que le le produit de PCR va être déjà amplifié avec des amorces spécifiques du gène d'intérêt ciblé par les TALEN, un gel d'agarose suffit d'après mon raisonnement.  [...] J'imagine que la mutagénèse par cette technique des TALENs (c'est un produit commercial, regarde sa notice) se fait in vivo donc en utilisant la machinerie de la bactérie (ou d'un autre organisme), le clonage du produit de PCR dans le vecteur permet de travailler avec le produit in vivo.  [...]

Expression de protéines

J'ai fait une expression de protéine taguée Histidine contenue dans un vecteur d'expression pTrcHis2B (protéine de Plasmodium falciparum ) dans des bactéries d'expression Rosetta 2, seulement lors de l'extraction de cette protéine puis dépôt sur gel j'ai 2 tailles différentes de cette même protéine.  [...] Si tu es certain que les deux bandes correspondent à ta protéine (la mass spec est de loin la méthode la plus fiable, bien plus qu'un WB), tu as probablement eu une protéolyse spontanée. Il faudrait savoir si ta bande de plus haut poids correspond à la masse attendue pour ta protéine, auquel cas tu aurais de la protéine intacte en fraction soluble et de la protéine clivée en fraction insoluble.   [...]

Vecteur de clonage, PCR et vecteur d'expression

Ils disent ensuite que le produit de PCR () est purifié par électrophorèse sur gel d'agarose et ensuite il est encore inséré dans un autre vecteur entry vector en utilisant une deuxième PCR(). Puis ils utilisent enfin un vecteur d'expression pour obtenir la protéine de fusion GST-gene d'intérêt.  [...] C'est assez simple en fait. Le gene d'interet etait deja present sur un plasmide mais qui ne leur convenait pas. Ils ont donc amplifié le gene par PCR, on purifier le produit d'amplification sur gel pour se debarasser du plasmid ayant servi de matrice, pour cloner le tout dans un plasmide permettant l'expression de la protéine.  [...]

Clonage par PCR

J'ai une petite question... j'aimerais savoir a quoi correspond exactement l'expression clonage par PCR. Est-ce quand on ajoute en 5' de l'amorce la sequence specifique d'un site de restriction, ce qui permet ensuite de liger le produit de pcr dans un vecteur contenant le meme site de restriction (en resume) Ou bien est-ce autre chose.  [...] Je pense qu'il s'agit tout simplement d'un clonage à partir d'ADN que tu as amplifié par PCR q'il s'agisse d'une ligation après digestion enzymatique ou autre.   [...]

[Biologie Moléculaire] Problème vecteur d'expression CDC25

Pour cela je dois faire une protéine de fusion, j'ai pensé a la GST mais je cherche comment l'exprimer, j'ai choisi E.coli, est-ce une bonne idée.   [...] Mais je suis bloqué pour l'expression de la protéine, je ne sais pas quel vecteur d'expression, producteur inductible ni enzyme de restriction prendre. J'ai regardé sur clonetech pour le vecteur mais je ne sais pas pourquoi choisir un vecteur et pas l'autre.  [...]

[Biologie Cellulaire] vecteurs

- le fait de pouvoir induire l 'expression d'un gène permet de s'assurer que le phénomène observé n'est pas lié à l'introduction du vecteur lui-même. ainsi, c'est uniquement au moment où l'on induit l'expression qu'il se passe quelque chose de significative, et quand on l'arrête, le phénomène n' a pas lieu.  [...] Oui, on retrouve tous ces éléments dans les deux types de vecteurs. Ce qui change, c'est la nature des signaux d'initiation de transcriptions (constitutifs ou inductibles) et, pour les vecteur d'expression transitoires, des gènes codant des répresseurs/inducteurs (voir le système tetON/ tetOFF).  [...]

[Biologie Cellulaire] Vecteur d'expression transitoire

Mais comment va se faire l'expression en fait Des facteurs de transcription vont reconnaître le promoteur et l'activer, entrainant l'arrivée de l'ARN polymérase (comme un gène normal).  [...] Tout à fait, c'est ce qu'il faut mettre dans ton vecteur d'expression, et tu peux rajouter aussi entre la séquence codante et le signal de polyadénylation une séquence intronique. Habituellement on utilise celle du virus SV40. L'épissage du pré-ARNm favorise l'export de l'ARNm qui fait partie des régulations de l'expression génique eucaryote, et donc là tu favorise encore une production massive de ta protéine.  [...]

dégradation de protéine recombinante

Je rencontre actuellement un problème lors de l'expression et la purif d'une prot recombinante. j'utilise le vecteur d'esxpression pQE30 et je purifie sur colonne NI-NTA, mais voila lorsque que je charge le produit de ma purif sur gel SDS j'observe bien la protéine d'intérêt à la MM attendue mais également des bandes de MM plus basse.  [...] Ca devrait ameliorer pas mal les choses, je pense. Le PMSF, c'est une bonne chose, ça permet d'éliminer toutes les sérines-protéases (comme la trypsine). L'EDTA à la fin est important aussi, il élimine les métallo-protéases qui sont présentes en masse dans beaucoup de systèmes d'expression, notamment en bactéries il me semble.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage orienté, design d'amorces

Je me prend le choux depuis le début de la semaine sur la conception de mes amorces pour réaliser un clonage orienté dans des vecteurs d'expressions (un GST. pGEX-5X-1. un HIS. pQE30).  [...] Pour le sous-clonage, c'est juste que j'ai envie de gagner du temps. Si je peux directement passer mon produit d'amplification dans mon vecteur d'expression, ça me fait gagner 2/3 jours ^^. Donc je cherche à savoir si c'est possible et si oui comment (précaution à prendre, etc.  [...]