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[Biologie Moléculaire] PCR et témoin négatif

une autre question, comment faire pr estimer la taille des bandes sachant que l'on dépose 7µL de produits PCR mais que la ladder correspond a 500ng d'ADN.  [...] Concernant la quantité relative. En général pour les ladders commerciaux, on peut connaitre la quantité d'ADN pour une ou plusieurs bandes du marqueurs de taille. Apres il faut comparer l'intensité du produit de PCR avec l'intensité des bandes du marqueurs de taille.  [...]

western

J'ai pour cela augmenté la concentration de mon gel de separation (jusque 15% ce qui correspond à une protéine de 28Kd). Cependant certaines bandes non spécifiques restent trop larges (en hauteur) et empechent une bonne visualisation de ma bande d'interet.  [...] Et j'ai eu des bandes bizarres s'il y avait un vide de côté. Ton échantillon est entouré d'autres échantillons ou de marqueurs de taille S'il y a un vide, ca peut expliquer que les bandes ne soient pas toujours parallèles.  [...]

Dosage sur gel

Hélas, il y a un écart de taille conséquent (je suppose, de mes souvenirs de ce marqueurs) entre les bandes entourées et celles qui iraient le mieux. Si tu veux utiliser quand à tout prix les bandes rouges du ladder, tiens compte de la différence de taille (il suffit de pondérer par le rapport des deux tailles).  [...] Ceci dit, je conseille de doser avec des intensités ni trop faibles, ni trop fortes. ici, la quantité de ton produit de PCR est si importante que le gel sature. J'aurai conseillé à un stagiaire d'exposer un peu moins fort pour vérifier que D3 n'est pas une double bande.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagenèse par PCR : Tm des oligos

Encore une question puisque vous parliez de bandes. on a fait une migration sur gel pour voir si ça a marché et on avait pas de bandes (sauf celle des oligos) mais par contre les marqueurs de taille ont très bien migré. Ca ne veut pas forcement dire que notre PCR n'a pas marché non Sinon pourquoi elle aurait pas marché Erreurs de manipulation plasmide incorrect.  [...] Justement la suite du TP était une digestion par Dpn1 et après de transformer des bactéries avec ce produit de PCR. nous avons eu quelques colonies mais pas assez de temps pour les laisser grossir et pouvoir voir qu'elle étaient vertes ou bleues, et en plus on était pas équipé pour le voir.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sous-clonage et taille des fragments

Tu indiques 10 bandes dans le marqueur mais j'en compte 11 sur le gel, c'est donc possible que toutes tes estimations de taille soient décalées.  [...] Alors effectivement, j'ai oublié de glisser une taille pour les poids de marqueurs moléculaires, il manque le 5Kb au milieu. Il y a donc bien 11 bandes. Ce qui ne change pas le problème au final.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de migration électrophorèse (produits bloqués dans les puits)

3. Tes marqueurs de poids moléculaires ne sont pas bons non plus. Normalement tu devrais avoir des bandes très nettes. Tu as même un léger signal au niveau de tes puits, ce qui devrait pas être le cas.  [...] Cependant, malgré plusieurs dilution des produits PCR bloqués (1/2, 1/4 et 1/8) je n'ai pas réussi à faire migrer ces produits. Il ne s'agit pas de l'agarose puisque sur le même gel j'ai des produits qui migrent (d'une autre PCR) et ceux qui bloquent qui ne migrent pas.  [...]

Demande d'aide pour un exercice

Le critère de séparation des fragments est leurs nombres de paires de base. L'électrophorèse sépare 11 fragments d'ADN. Grâce à des marqueurs de poids moléculaires, on estime leurs longueurs comme variant de 220 à 260 paires de bases. Les différentes bandes ou fragments identifiées sont ensuite découpées dans le gel d' agarose.  [...] J'aime bien votre conclusion et l'ouverture sur l'étude de l'ADN. J'aime moins la mise en perspective assez négative sur la validité de l'expérience. La validité d'une expérience se critique sur des bases scientifiques. On suppose toujours que la personne qui présente ses résultats n'a pas fait d'erreur idiote de manipulation, qu'il a bien reproduit ses résultats plusieurs fois.  [...]

[Biochimie] Marqueur de taille

Lors d'un TP de biochimie je devais déterminer le masse moléculaire de protéines par électrophorèse. J'ai pour cela utilisé un marqueur de taille contenant 13 molécules.  [...] Bonjour, c'est assez classique avec les marqueurs de taille, pour les voir toutes il faut des gels à gradient. La solution c'est de se baser sur l'épaisseur des bandes, en général il y en a des plus importantes, ou alors l'agencement entre elle, il faut regarder sur la notice.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

La première chose à faire, c'est de savoir si le problème est lié à ta protéine ou au transfert. Il y a des marqueurs de poids moléculaires commerciaux qui vont au moins jusqu'à 250 kDa, il faut donc savoir si dans les conditions de ton gel les bandes du marqueur sont transférées ou non.  [...] Donc à priori, tu as de la protéine, elle est sans doute intacte, sa taille n'est probablement pas un problème majeur puisque des bandes de marqueur plus grosses sont transférées et le WB est tout de même négatif... Pas simple. J'ai une autre idée. sauf erreur de ma part, ta protéine vient d'un extrait cellulaire eucaryote.  [...]

[Microbiologie] extraction d'ADN

s'il vous plaît mon encadreur m'a demandé de faire migrer les protéines SDS PAGE en puits confondus je ne sais même pas de quoi il s'agit je n'ai pas osé lui poser la question comment faire.   [...] et pr la SDS page c est une electrophorese qui fait denaturer tn adn. c est un long mecanisme mais facile a appliquer, l essetiel c est qur tn adn denaturé va migrer et pour la revelation t utulise le.bleu de comassie, et dans un des puits tu dois aussi mettre des marqueurs de taille finilamnt t recupere tn gel et tu verifie tes bandes. j espere que je ne me trompe pas.  [...]