• Forum - Production, Protéine, Plasmide

[Biotechnologie] Global Analysis of Protein Activities using proteome chips

En gros, la séquence d'ADN codant pour la protéine d'intérêt est fusionnée à une séquence signal (GST), puis des levures sont transfectées par le plasmide. Donc production de la protéine correctement modifiée et conformée (la protéine d'origine provient de la levure).  [...] Et est ce que ils utilisent des techniques généralement utilisé en protéomique, quels sont leur noms (pour la création de la puce, pour l'interactions protéines-protéines, et pour l'interaction protéine lipides ).  [...]

[Biotechnologie] Interférence à l'ARN

- les shRNA, pour small hairpin. Ces ARN interférants sont aménés dans la cellule par transfection (plasmide) ou infection (lentivirus, AAV, adénovirus). Il y a ainsi production par la cellule de shRNA, dirigé contre l'ARNm de la protéine d'interêt. Pour détailler un peu plus les shRNA, ils sont transcrit comme n'importe quelle protéine, mais ils possèdent la particularité d'avoir une séquence complémentaire en mirroir.  [...] Le plasmide doit être linéarisé pour que les enzymes recombinases soient actives. Grâce à la RH, ton gène X sera introduit à la place du Y. Cependant, la RH n'est pas optimale selon le modèle biologique car un autre mécanisme de réparation de l'ADN est présent, le Non Homologous End Joining (NHEJ) qui empêche la RH car le transgène s'insère de façon non-spécifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Il est possible d'obtenir de grande quantité de protéine en le faisait produire par des bactéries ayant reçu le plasmide recombinant contenant le gène cible.  [...] Se pose aussi le problème des modifications post traductionnelles, et dans ce cas on essai dans des levures humanisées par exemples (après tout dépend de ce que tu veux faire avec ta protéine. etudes structurales, fonctionnelles ou production pharma). Et en effet pour l'expression en bactéries on utilise un plasmide qui reste sous cette forme, il ne s'intègre pas dans le génome.  [...]

[Biologie Moléculaire] Exprimer une protéine fonctionnelle en plasmide

Pour m'assurer que ma protéine est fonctionnelle je dois insérer la séquence de mon cDNA du codon ATG au codon stop… jusque là ok.  [...] Mais seul le cDNA suffit à exprimer la protéine nan En considérant biensur que le promoteur soit déjà dans le plasmide Parce que en fait je ne comprends pas bien l'histoire de l'intron avant l'ATG.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunodétection après production d'une protéine recombinante

Lors d un TP nous avons transformé une souche E coli (rosetta) avec un plasmide recombinant afin de produire et purifier une proteine d interet. L expression du gene de cette proteine est sous la dependance du promoteur T7, et necessite ainsi l arn pol T7.  [...] Oui j ai fait un mauvais raccourci, je voulais dire que le gene etant apporté par un plasmide, il y en a donc plusieurs copies dans E Coli et une production plus importante de proteine lysozyme.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

Pour l'instant j'amplifie mon plasmide dans une souche de Coli DH5alpha. Instinctivement (après mes aventures dans le monde de la production en pET) j'allais passer sur une souche BL21 peu pratique à utiliser. Puis réflechissant un peu je me suis rendu compte que finalement la souche BL21 n'a surtout d'intérêt pour la production de protéines en pET que parce qu'elle permet l'utilisation du promoteur T7 du plasmide.  [...] Par rapport à mon vecteur pGEX5x1 on peut aussi voir qu'il y a de l'expression de protéines même sans induction (contrôle. DH5alpha non transfectées). Au bout de 2h l'induction n'a pas franchement dépassé la production endogène. Au bout de 12h la différence est très nette montrant que l'induction active bien le plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] différence entre 2 plasmides

Un plasmide d'expression est un plasmide qui une fois entré dans la cellule permet de produire une protéine alors qu'un plasmide reporter est une construction qui va permettre de reporter l'activité de la protéine synthétisée par le plasmide d'expression. Il s'agit le plus souvent d'un promoteur qui répond à la protéine produite qui est donc un facteur de transcription.  [...] Si la protéine se fixe sur le promoteur elle va induire la transcription et la traduction d'une protéine rapporteur le plus souvent la luciférase qui émet de la lumière. L'activité de la protéine testée va donc être rapportée par la quantité de lumière émise.  [...]

[Biologie Moléculaire] Phosphorylation sur tyrosine => dégradation par protéasome???

Pour l'instant c'est très préliminaire... En fait dans des analyses de co-transfection d'une protéine X et d'une tyrosine kinase Y, j'ai trouvé une diminution énorme de la qté de X qd cotransfecté avec Y... et in vitro je sais que Y phosphoryle X sur tyrosine.  [...] Alors en fait cette protéine est bien ubiquitinylé (.) par des complexes qui reconnaissent des sérines phosphorylées sur cette protéine. Pour ce qui est du MG-132 je n'ai pas encore fait le test. sinon pour ce qui est de la compétition d'expression j'ai fait un contrôle de transfection en cotransfectant le plasmide de la protéine X avec le vecteur d'expression vide de la protéine Y et de plus lorsque je cotransfecte le plasmide de ma prot X avec le plasmide de la kinase Y inactive j'ai l'effet inverse c'est à dire une accumulation d'X.  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent Clonage

Nous avons reçu un nouveau plasmide, je dois y faire exprimer une protéine. L'insert d'interet est exprimé dans un autre plasmide.  [...] La protéine que je veux exprimer doit avoir une GFP et un tag His, ces deux là sont déjà dans le nouveau plasmide, mai puisque je dois synthetiser mes amorces avec un codon stop, comment ces tags peuvent-ils etre lus.  [...]

[Génétique] Transfection transitoire plasmide/siRNA

Ma question concerne les mécanismes qui se mettent en place après une transfection transitoire d'un plasmide codant pour une protéine ou d'un siRNA. Je m'explique. quand on transfecte un plasmide d'expression codant pour la GFP par ex c'est transitoire cad qu'au bout de 48H la fluorescence commence à disparaître (dilution globale ou par cellule) que se passe-t-il pour la descendance.  [...] - la disparition progressive de la fluorescence est-elle due à la dilution de la population ou à la dégradation du plasmide et de la protéine exprimée. quelle cinétique.  [...]