• Forum - Plasmide, Vecteur, Expression

[Biologie Moléculaire] pCMX vecteur

Je viens de recevoir le vecteur d'expression pCMX mais l'expéditeur ne possédait pas la séquence ainsi que la carte. J'ai regardé sur le net mais impossible de trouver les caractéristiques de ce plasmide. J'aimerai savoir si quelqu'un possède ces informations ou sait où je peux les trouver.  [...] C'est le problème de la sous-traitance. Certains sous-traite leur travail (le clonage en particulier) et ne demandent pas les caractéristiques du plasmide du moment ou ils possèdent leur gène d'intéret dans un vecteur d'expression.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur pET

Quelqu'un sait-il ce que veut dire pET (le vecteur d'expression) p pour plasmide mais ET E. coli et phage T7.  [...] C'est un nom commercial, pas sur que ca veuille forcément dire quelquechose.   [...]

[Biologie Moléculaire] Système d'extinction conditionnel de gène in vivo

L'approche siRNA est simple, le knockdown transitoire dépend de la dilution progressive/dégradatio des siRNA injectés mais quid de son efficacité cad quelle quantité à injecter le ciblage spécifique du rein (en faite le shRNA peut très bien inhiber l'expression du gène dans d'autres organes).  [...] Si on part sur du shRNA, 2 approches s'offrent à nous. Elle sont ttes 2 basées sur une expression inductible du shRNA (system Tet).  [...]

[Biologie Moléculaire] Phosphorylation sur tyrosine => dégradation par protéasome???

Et est ce que ce n'est pas tout simplement un effet de compétition d'expression (ou de transfection) entre les deux plasmides Moi je commencerai par regarder ça avant de me lancer dans des explications physiologiques complexes.  [...] Alors en fait cette protéine est bien ubiquitinylé (.) par des complexes qui reconnaissent des sérines phosphorylées sur cette protéine. Pour ce qui est du MG-132 je n'ai pas encore fait le test. sinon pour ce qui est de la compétition d'expression j'ai fait un contrôle de transfection en cotransfectant le plasmide de la protéine X avec le vecteur d'expression vide de la protéine Y et de plus lorsque je cotransfecte le plasmide de ma prot X avec le plasmide de la kinase Y inactive j'ai l'effet inverse c'est à dire une accumulation d'X.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage Gateway...intérêt ?

Pour l'intérêt de tes 2 plasmides. générallement, ton second vecteur est un vecteur d'expression et non le premier vecteur...le premier vecteur te permet par exemple de séquencer le gène introduit...même si par précaution certains séquencent aussi après insertion dans le second vecteur (comme dit avant, les deux séquences sont censées être identique car pas de polymérase intervenant, il y a uniquement une recombinaison...).  [...] ça revient au même qu'avec les enzymes pour l'insertion dans ton second vecteur sauf que là encore, tu n'a pas besoin de rédigérer ton fragment à partir de ton premier plasmide pour le mettre dans un plasmide d'expression. Ici, avec le système gateway, ton plasmide d'entré va directement servir à la recombinaison avec ton second plasmide.  [...]

[Microbiologie] banque génomique

triction Eco RI, Eco RV et Pst I. le plasmide ou vecteur d'expression (pBlueScript) a été également traité par les mêmes enzymes. lig+transformation+criblage par pcr. je suis arrivée au séquençage. mon encadreur qui a vu la sé-.  [...] quence obtenue m'a informé que j'ai effectué une erreur lors de la digestion enzymatique. Je ne suis pas d'accord avec elle parce que je me suis dit que les amorces que j'ai pris sont spécifiqUES DU Gène Mm14 de la souche en question, mais je me suis dit que c'est en rapport avec le clone recombinant que j'ai obtenu (ADN digéré par Eco RV).   [...]

[Biologie Moléculaire] "Vectorologie" : le cPPT ?

Dans le vecteur permettant l'expression du plasmide dans les cellules eucaryotes (alternativement il sert aussi à la production des particules), il y a juste après le site d'insertion du shRNA un site appelé cPPT pour central Polypurine Tract.  [...] En gros et pour faire simple ce motif PPT sert pendant la RT de ton ARN en ADN, c'est un motif qui reste après action de la RNaseH et qui sert ainsi d'amorce pour la RT pour l'initiation de synthèse du 2ème brin d'ADN.   [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteur d'expression

Je n'ai pas vraiment compris comment on fabriquait un vecteur d'expression. Je m'embrouille avec ces histoires d'enzymes de restriction et de gènes codant pour la résistance à l'ampicilline, etc.  [...] Les gènes codant pour une resistance à l'ampicilline par exemple permettent de sélectionner les bactéries qui ont reçu le transgène. Mais pour ce qui est de l'amplification pour obtenir de grandes quantités de plasmide, c'est tout bête mais l'origine de réplication permet de répliquer le vecteur dans une même bactérie ou bien chez les cellules filles aprés mitose.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

Par rapport à mon vecteur pGEX5x1 on peut aussi voir qu'il y a de l'expression de protéines même sans induction (contrôle. DH5alpha non transfectées). Au bout de 2h l'induction n'a pas franchement dépassé la production endogène. Au bout de 12h la différence est très nette montrant que l'induction active bien le plasmide.  [...] Conclusion. On peut produire des protéines en DH5alpha grâce aux vecteurs pGEX. Cependant la dégradation induite par les protéases ne semble pas négligeable. Le represseur LacI q du vecteur n'eteint pas totalement l'expression du gène chimère. Peut être un problème à prendre en considération pour les protéines toxiques.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Tous les promoteurs eucaryotes ne sont pas identiques certains fonctionne chez d'autres espèces (en général ce sont des gènes issus d'organismes pathogènes) mais selon mon expérience la plupart du temps ça ne marche pas. C'est pourquoi on utilise des plasmide dit d'expression qui ont un promoteur et un terminateur plus ou moins fort en fonction de ce que tu veux faire voir même inductible, provenant en général de l'organisme hôte.  [...] Sinon c'est un gène humain, je sais que le promoteur naturel est assez fort mais quand je transforme une lignée cellulaire avec un plasmide bactérien (donc sans origine de réplication eucaryote) contenant ce gène je n'observe aucune expression. Je cherche donc a savoir si le problème vient du vecteur bactérien ou non avant de me lancer dans le clonage du gène dans un vecteur eucaryote.  [...]