• Forum - Plasmide, Tampon, Enzyme, Digestion, Solution

[Microbiologie] digestion de plasmide

j'ai digéré mon plasmide pbluescript avec ECOR I le problème c'est que je me suis rendue compte après que le tampon OPA seul avec le plasmide sans Enzyme provoque une digestion de ce dernier donc le tampon contient des endonucléases sachant que je ne peux pas jeter le tampon parce que sinon je dois patienter 3 mois pour recevoir la prochaine commande une dilution de tampon serait elle efficace pour se débarrasser des nucléases Même si je sais que ce n'est pas la bonne solution.  [...] Si dans le tampon que tu as utilisé y a des nucléases, tu peux balancer ta restriction que tu as faites (car ton ADN est coupé dans tous les sens) et la refaire avec un tampon plus adapté. Si je me trompe pas, un bête tampon H fera l'affaire pour une digestion EcoRI de pBluescript (le tampon est fourni avec l'enzyme).  [...]

[Biologie Moléculaire] Utilisation de Klenow

Je voudrais juste savoir si je peux utiliser la klenow directement apres ma restriction sans inactiver au prealable l'enzyme de restriction et sans purifier le plasmide linearise a partir d'un gel.  [...] il faut inactiver l'enzyme préalablement, sinon elle va continuer a couper. Pas besoin de purifier le plasmide, tu peux le faire ensuite. Il faut quand même que la klenow puisse fonctionner dans le tampon utilisé pour la digestion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Tampon 10X, 1X???

que signifie un tampon de digestion est ce un tampon ayant le même rôle d'un tampon normal composé de son acide faible et base conjuguée(ou inversement) et permettant la résistance aux changements de concentration des ions H+ ds une solution induits par la digestion.  [...] Pour ce qui est du tampon de digestion il s'agit si je ne me trompe pas du tampon que tu associes avec une enzyme de digestion (par exemple si tu utilises BamHI, tu la mets avec du tampon BamHI) tout comme il existe des tampons ligase... Niveau composition je ne sais pas trop mais ce qui est sûr c'est qu'il remplit bien le rôle d'un tampon normal.  [...]

Carte de restriction d'un plasmide inconnu

Sachant que l'on doit choisir 5 à 6 enzymes. Deja dans un premier temps comment peut on savoir lesquels choisir préférentiellement Est ce que le choix des enzymes auraient juste avoir avec les couples d'enzymes qui ont une bonne activité ensemble pour pouvoir les coupler lors des digestion avec un même tampon Je compte faire mes digestions et analyser sur gel d'électrophorèse d'agarose à 1% (ne connaissant pas du tout la taille du plasmide je suppose qu'il a plus de chance de se trouver entre 10kb et 0.  [...] Ensuite, il n'est pas possible de mélanger toute les enzymes. Soyons fou, et admettons que tu veuille mettre ton plasmide et tes 6 enzymes en même temps. Tu va devoir choisir un tampon de digestion (ph, concentration en sel) unique pour toute tes enzymes. et certaines ne fonctionneront alors pas (enfin, il est possible une astuce, mais pas avec un choix restreint d'Ez).  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

derniere chose, n'oublie pas qu'il ne faut pas depasser 10% de ton volume total en enzyme de restriction. Sinon le glycerol qu'elles contiennent fini par totalement perturbé ta digestion (inhibition, activité star etc...).  [...] Le top pour la digestion (selon protocole promega/ NE Biolabs, teste et approuve par tout le labo) C'est 50 uL volume final (ADN purifie, pas tout juste sorti de PCR), et max 2 uL d'enzyme. Un volume plus petit ca coupe mal, et plus d'enzyme au mieux ca change rien, au pire ca coupe mal ou avec activite star.  [...]

Carte de restriction d'un plasmide

Des digestions avec une ou 2 enzymes sont réalisées, les produits de la digestion sont soumis à une électrophorèse. On dtermine pour chaque puits le nombre et la taille des fragments de restriction par comparaison avec la migration de fragments d'ADN de taille connue. Les résultats sont dans le tableau suivant.  [...] Question confuse. Dans un plasmide recombinant on a un vecteur et un insert. L'ADN génomique humain a une taille d'environ 3 000 000 000 Nt. Mais je suppose que c'est la taille de l'insert du plasmique recombinant que tu veux.  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction sur plasmides- Digestion complète et incomplète

Par exemple, pour un plasmide ayant 3 sites de coupures, le nombre de fragments attendu (théorique) est de 6 si l'on considère tout les fragments possible et imaginable. Mais dans le cas d'une digestion incomplète, comment savoir s'il y aura 1 seul site ou 2 site qui seront impliqué dans la digestion du plasmide.  [...] La digestion incomplète est une digestion qui n'est pas efficace sur l'ensemble des molécules du substrat. Exemple. la moitié des plasmides sont digérés, l'autre moitié est intécte. Elle se produit quand l'enzyme n'est pas bien dosée, qu'elle n'est pas très active, que la température ou le tampon ne sont pas bien ajustés,  [...]

[Biochimie] Localisation de la B-galactosidase

Je voudrais savoir où se situe PRECISEMENT la B-galactosidase dans le corps humain. Peut-elle fonctionner à un pH de 4.2 (j'ai vu sur wikipédia pH optimum entre 6 et 8 mais existe-t-il d'autres formes de cette enzyme Car j'ai également vu sur un site anglais qu'elle pouvait fonctionner comme un lysozyme à pH = 4.5).  [...] Bsr, à partir de mes restreintes informations sur cet enzyme, je peux vous dire ( je crois ) que le B-galactosidase est l'enzyme qui fait catalyser l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose, donc elle appartient à des enzymes de digestion, donc dans le système digestif, et pour l'acidité, on a manipulé cette réaction in vitro avec un tampon pH 7. je ne sais plus de ça dsl ^^.  [...]

calcul dilution plasmide

dans le protocole que j ai en nous demande de prendre 5ug du plasmide la concentration de mon plasmide quand je l ai verifier au nanodrop est de 43ng/ul.  [...] et dans se protocole le volume final est de 50ul est ce que vous pouvez m aider pour savoir combien de ul de ce plasmide je dois utiliser.  [...]

Problème lors de ligation

J'ai un plasmide pcDNA3 contenant un insert qui est situé entre deux sites de restrictions Xho I, je digère ce plasmide avec l'enzyme Xho I puis je fais migrer dans un gel TAE 1% avant de récupérer mon insert et mon plasmide ouvert ( grâce à un kit wizard).  [...] Je précise que j'ai vérifié qu'il n'y avais pas de conta dans la BSA ou le tampon on l'enzyme en réalisant un digestion sur un autre vecteur ou cela fonctionne.  [...]