• Forum - Plasmide, Séquences, Sélection, Réplication

vecteurs

un vecteur de clonage a pour fonction d'amplifier un bout d'ADN (codant pour un gene la plupart du temps), ca correspond typiquement a un plasmide qui possede les sequences necessaires de selection et de replication.  [...] Bonjour moi je souhaiterais savoir la methode pour placer le gene de la luciferase sous le controle d'un promoteur precis.Comment faire pour obtenir la sequence que l'on souhaite Merci beaucoup.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

Pour choisir un vecteur, il te faut regarder la force de l'origine de réplication (qui détermine le nombre de copies de plasmide dans la bactérie), les résistances aux antibiotiques (sélection des bactéries intégrant le plasmide), la présence d'autres marqueurs de sélection comme la beta-galactosidase, le type de système d'expression (promoteur euca/procaryote, RBS pour traduction chez procaryote,  [...] Pour ce qui est finalement du choix du vecteur, il te faut un vecteur contenant une origine de réplication procaryote, un gène de résistance à un antibiotique et pourquoi pas le gène beta-galactosidase à cheval du polylinker (cela permet de sélectionner les bactéries qui ont un plasmide ayant intégré un insert), et bien sûr le polylinker.  [...]

[Biotechnologie] Plasmide recombinant

7) Lors de l'utilisation d'agrobacterium tuméfaciens, on crée un plasmide contenant un gène de résistance pour E.Coli et pour la plante, une origine de réplication E.Coli, une origine pour Agrobacterium, et puis deux séquence front gauche et front droit dans lequel on retrouve le gène d'intérêt ainsi qu'un gène de sélection pour la plante.  [...] Donc, notre chère Agrobacterium possède ce que l'on peut appeler un mégaplasmide (taille = 200kb), appelé pTi, qui a une OR (Origine de Réplication), une région appelée Vir, une séquence appelée T-DNA, entourée de LB et RB (séquences inversées répétées, orientées dans la même direction) et une région Occ.  [...]

cellules souches

Pour une définition simple et accessible à tout péquin, comment s'y prend-on pour cultiver de telles cellules, aspect pratique, basique.   [...] Un plasmide est une molécule d'ADN circulaire capable de se multiplier de manière autonome dans un organisme procaryote ou eucaryote. Il possède une origine de réplication, un gène de sélection et généralement de multiples sites de clonage pour y insérer un fragment d'intérêt. =. définition de FS.  [...]

[Génétique] exprimer une protéine dans E.COLI

Ensuite, tu l'insert dans un plasmide, possédant une origine de réplication E.Coli, avec un gène de sélection (ex.. Résistance à lampiciline).  [...] il n'y a pas de plasmide replicatif pour les cellules de mammiferes. Au moins tu fais de l'expression transitoire, sinon tu utilises des vecteurs viraux.  [...]

[Microbiologie] Plasmide 2Mu chez la levure Saccharomyces cerevisiae

J'aurai besoin d'explications sur le phénomène de réplication du plasmide 2µ de la levure. Je n'arrive pas à imaginer clairement le système de recombinaison qui intervient entre les deux séquences flip, système qui permet la formation d'un long concatémère 2µ.  [...] Je comprends le principe général, mais je saisis pas l'histoire du changement de sens des fourches réplicationnelles.  [...]

[Biologie Cellulaire] Vecteur d'expression transitoire

Il me semble que non, car tant qu'il n'a pas intégré le genome de la cellule hôte, comment pourrait-il initier sa transcription sans séquence ORI.  [...] Et dernière chose, pour la production des plasmides dans des bactéries, il ne faut pas qu'une origine de réplication procaryote (Ori) mais aussi des séquence codant un ou plusieurs gènes de résistance à des antibiotiques (habituellement 2) pour sélectionner les bactéries qui ont intégré le plasmide dans un milieu de culture contenant les antibiotiques.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

la transfection de cellules eucaryotes est possible. Par lipofection, éléctro, microbalistique etc...Par contre contrairement au bactérie va se poser le problème de réplication. Car le plasmide n'est pas au réplicome dans les cellules eucaryotes supérieur.  [...] Des séquences contenues au sein d'un plasmide peuvent s'intégrer par recombinaison homologue dans l'ADN génomique d'une cellule eucaryote. Ce procédé peut être réalisé avec une transfection classique suivie d'étapes de sélection (G418 le plus souvent) sur plusieurs semaines pour sélectionner les clones stables. on parle alors de transfection stable.  [...]

[Biologie Moléculaire] siRNA, shRNA ??

Donc l'action d'un siRNA est forcément transitoire, tandis qu'avec le shRNA, si tu maintiens une pression de sélection, le plasmide sera exprimé de façon permanente et donc le silencing durera... De plus, si tu as un promoteur particulier, ça te permet d'avoir un silencing inductible.  [...] Bien sûr mais la pression de sélection ne permet que de sélectionner les plasmides intégrés et les plasmides épisomaux répliqués. Dans ce dernier cas, il leur faut une origine de réplication exploitable par la cellule transfectée, comme par exemple un plasmide contenant l'origine de SV40 avec les cellules COS-7 qui possèdent l'antigène T nécessaire pour répliquer les plasmides contenant cette origine.  [...]

[Génétique] Systeme GAL4/UAS

On utilise des séquences d'élément p modifiées qu'on insert dans un plasmide. En l'occurrence, dans ce plasmide, on va mettre le gène gal4 entre les pieds de p. Ce sont les séquences 5' et 3' de l'élément p qui vont s'exciser du plasmide pour aller ensuite s'insérer aléatoirement dans le génome.  [...] Au passage, il existe de nombreux plasmides avec des éléments p modifiés, on n'est pas obligé de repartir de 0 à chaque fois. Il y a des plasmides avec des p-gal4, il ne reste plus qu'à cloner les séquences régulatrices qu'on veut dans un site de restriction devant gal4.  [...]