• Forum - Plasmide, Expression, Protéine

[Biologie Moléculaire] Phosphorylation sur tyrosine => dégradation par protéasome???

Alors en fait cette protéine est bien ubiquitinylé (.) par des complexes qui reconnaissent des sérines phosphorylées sur cette protéine. Pour ce qui est du MG-132 je n'ai pas encore fait le test. sinon pour ce qui est de la compétition d'expression j'ai fait un contrôle de transfection en cotransfectant le plasmide de la protéine X avec le vecteur d'expression vide de la protéine Y et de plus lorsque je cotransfecte le plasmide de ma prot X avec le plasmide de la kinase Y inactive j'ai l'effet inverse c'est à dire une accumulation d'X.  [...] Désolé de continuer sur le hors-sujet mais qu'appelez-vous phosphorylation in vivo Quelles méthodes pour l'évaluer Western sur la protéine cible avec un anticorps dirigé contre un phosphoépitope généré par la kinase Surexpression de la kinase, incubation brève avec P32, immunoprécipitation de la cible, gel SDS-PAGE puis autoradiographie Inversement avec surexpression de la cible,  [...]

Protéine dépendante d'ions pour une oxydation chez E.Coli

Je cherche une protéine ( si possible dont la séquence est déjà clonée dans un plasmide d'expression chez E.Coli ), qui puisse effectuer une oxydation mais seulement en présence d'un certain seuil de concentration en Ions ( Na+, Cl-, Ca2+ etc ).  [...] Je n'ai pas trouvé d'enzyme qui oxyderait une autre enzyme, mais la luciférase (de luciole en particulier) peut être intéressante C'est de loin la protéine qui remplit le plus le cahier des charges.  [...]

[Biologie Moléculaire] transfection transitoire/stable

l'expression transitoire est due au fait que le plasmide exprime la proteine mais comme ce plasmide ne se replique pas il est perdu au cours des divisions cellulaires.  [...] D'après moi transitoire c'est jusque 48h environ. après 7 jours de séléction et donc de divisions tu n'es plus en transitoire... mais après ça dépend surement des cellules sur lesquelles tu travailles et de leur rythme de divisions.   [...]

Transfection plasmide gateway et faible expression proteique

J'essaye en ce moment de transfecter un plasmide pDEST40 (construit avec technologie gateway) et j'obtiens une expression proteique vraiment très faible.  [...] Au delà de mes manip, j'aurais quand même voulu savoir pourquoi ce plasmide nous donnes une si faible expression protéique...par curiosité.  [...]

[Biochimie] Expression anormale d'une protéine exogène

Nous avons ensuite pris un nouveau stock de HEK qui ont fait exactement la même chose. a savoir qu'au départ l'expression était correcte puis la protéine s'est retrouvée bloqué dans le cytoplasme. Comment peut on expliquer ce type de changement dans l'expression et surtout que faire.  [...] Je suis en train d'essayer de faire la même expérience avec des Hela. Ma préparation de plasmide à environ 1 ans mais je fais naturellement des aliquots et mon stock courant n'est pas congelé mais conservé à 4°C. Concernant l'agent de transfection cela n'explique pas pourquoi lors de mes premières expériences je me suis trouvé avec une expression correcte de la protéine et pas par la suite.  [...]

[Biologie Moléculaire] Exprimer une protéine fonctionnelle en plasmide

Il semble que la présence d'un intron favorise une bonne expression dans certains cas. D'un autre coté ca peut poser d'autre probleme lors d'une surexpression. En général on clone un cDNA, maintenant si les tailles sont compatibles on peut cloner l'ADN avec ses introns.  [...] Mais seul le cDNA suffit à exprimer la protéine nan En considérant biensur que le promoteur soit déjà dans le plasmide Parce que en fait je ne comprends pas bien l'histoire de l'intron avant l'ATG.  [...]

[Biotechnologie] Induction vs. expression

Par exemple, tu va avoir une séquence avec un promoteur inductible, qui une fois activé induira l'expression de la protéine en amont de la séquence.  [...] Donc, si je comprends, tu as un plasmide recombiné provenant de pET. Le mieux ce serait que tu regardes les différentes cartes de plasmides et que tu dessines une carte de ton plasmide recombiné avec les promoteurs et que tu schématises les différentes interactions dans ta bactos d'expression.  [...]

[Biologie Moléculaire] Fournisseur plasmide d'expression (avec ORF spécifique)

Je recherche une boite qui pourrait me fournir (rapidement) un plasmide d'expression avec l'ORF de mon choix (de la même manière que l'on choisi des siRNA dans une banque).  [...] J'ai un plasmide gateway (sans promoteur) de chez Invitrogen et je suis déjà en train de faire sortir la séquence pour la mettre dans un pDEST, mais nous avons quelques problèmes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transfection siRNA et plasmide

Si tel est le cas, j'ai eu discussion avec des collègues sur la meilleure marche à suivre. Quelle serait la meilleure procédure D'abord introduire le siRNA, puis le plasmide (sachant que mon siRNA produit un effet jusqu'à environ 72h, et qu'un plasmide en général produit un pic d'expression entre 24 et 48h) Ou bien tout balancer dans la même session.  [...] Perso, moi je serais plutôt pour le siRNA d'abord, le lendemain transfection du plasmide, et le surlendemain récupération de ton TF, soit environ 48 heures de knock-down et 24 heures d'expression, ça me semble être le mieux, enfin l'expérience parlera par elle-même.  [...]

[Biochimie] Dégradation tag et protéase

Pourquoi te compliquer a faire des fusions quand il suffit de controler l'expression de sspB sspB s'exprime vite et tres bien avec le plasmide decrit dans le papier mol. cel.  [...] De plus, ils surexpriment Arc via un plasmide, ca ne m'etonnerais pas qu'ils sur expressent Arc au point de saturer le systeme et donc d'avoir pas mal d'Arc soluble et dans le cytoplasme. Du coup la degradation initiale est probablement juste la degradation de la proteine soluble.  [...]