• Forum - Plasmide, Enzyme, Restriction

[Biologie Moléculaire] Gène0 AOX1!!

1) Enzyme de restriction spécifique à AOX1 ainsi qu'au plasmide vecteur de clonage. Donc découpage des deux au bon endroit.  [...] 2) Insertion du promoteur dans le plasmide et reapariment de base car notre enzyme de restriction est spécifique et a couper notre fragment au bon endroit.  [...]

[Biologie Moléculaire] mutagènese, transformation, transfection

Ce que je comprends c'est que vous avez fait une mutagénèse dirigée par PCR à partir d'un plasmide X. Pour éliminer le plasmide matrice X vous avez utilisé la spécificité de l'enzyme de restriction DpnI pour les sites méthylés. Ainsi, l'enzyme a digéré le plasmide matrice, produit en bactérie (donc méthylé) et pas le plasmide produit par PCR, non méthylé.  [...] Pour vérifier une mutagénèse sur un petit insert (d'un ordre de grandeur inférieur au 10Kb) le plus simple est de faire quelques restrictions et un séquençage. Vous n'avez pas fait de séquençage du Bluescript.  [...]

[Biologie Moléculaire] Utilisation de Klenow

Je viens de digerer un plasmide (pour le lineariser) avec une enzyme creant des bout cohesifs (extremite 5' depassant). Je voudrais rendre cette extrimite blunt en utilisant une klenow.  [...] Je voudrais juste savoir si je peux utiliser la klenow directement apres ma restriction sans inactiver au prealable l'enzyme de restriction et sans purifier le plasmide linearise a partir d'un gel.  [...]

[Biochimie] nucléase

Tu commences par ouvrir ton plasmide avec une enzyme de restriction, tu fais agir ta phosphatase, et tu peux ensuite tranquillement faire ta réaction de ligation entre ton transgène et le plasmide (et ainsi éviter que ton plasmide ne se referme sur lui-même et d'avoir bossé pour rien).  [...] Parce que si oui, découper ton plasmide par deux enzymes différentes est important 1. non seulement pour éviter qu'il ne se referme sur lui-même mais aussi 2. pour que tu puisses ORIENTER ton insert.  [...]

calcul dilution plasmide

dans le protocole que j ai en nous demande de prendre 5ug du plasmide la concentration de mon plasmide quand je l ai verifier au nanodrop est de 43ng/ul.  [...] ou carrément reconcentre mon plasmide car sa donne 116ul et le volume final dans le protocole doit etre de 100ul donc c impossible.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR colonie et PCR ADN

Quand tu dis que le plasmide est présent seul dans la miniprep, sais tu si il est sous forme linéaire ou circularisé par la ligation. (Une digestion avec une seule enzyme devrait donner 2 fragments si il est linéaire). Imaginons que la ligation ne fasse que circulariser le plasmide sans introduire l'insert, ça pourrait conférer la résistance et la PCR positive proviendrait de l'insert qui est transformé en même temps.  [...] -Une enzyme de restriction ne coupe pas et j'ai donc des plasmides refermés avec des inserts dans mes colonies ce qui fait que je peux amplifier l'insert, et que je le perd ensuite.  [...]

Technique Gateway

c'est un système plus efficace que l'ensemble enzyme de restriction + ligase pour faire passer un fragment de DNA d'un plasmide à un autre,  [...] On passe d'abord par une première recombinaison en plasmide donneur et on obtient un clone d'entrée. Tu va pouvoir multiplier ce plasmide et en stocker une grosse partie, afin de réaliser d'autres clonages ultérieurs, dans des tas de vecteurs de destination différents. D'où l'intérêt de cette étape supplémentaire.  [...]

extraction plasmide

je viens de faire digérer un plasmide avec une enzyme de restriction BSER1 puis je l ai purifiée et j ai eu deux barres avec la révélation sous uv mais la j aimerai extraire la deuxième bande pour que sa se recolle pas a mon plasmide mais je sais pas quel méthode utiliser.  [...]

[Génétique] Plasmide

slt tt le monde, j'ai une petite question afin de mieux comprendre un exo, après avoir digéré des plamides à l'aide d'une enzyme de restriction, sa change quoi qu'on les religue à forte ou à faible concentration.  [...] si tu digéres ton plasmide avec une seule enzyme de restriction et qu'après tu religues le plasmide tu peux alors imaginer deux types de ligation.  [...]

[Biologie Moléculaire] electrophorèse en gel d'agarose

Merci pour votre réponse. (je connais mon cours et ca fait longtemps que je cherchais la réponse à ma question). ce que je ne comprenais pas c'est que dans mon énoncé on me parle d'un plasmide et non d'une cellule. on a digéré le plasmide pBR322 par différentes enzymes de restriction.  [...] mais dans ce cas, si je fais agir une enzyme de restriction qui n'a qu'un site de restriction sur le plasmide il faut que la digestion soit complète pour que je n'obtienne que des fragements de même taille et même volume.  [...]