• Forum - Plasmide, Contrôle, Expression

[Biologie Cellulaire] probleme de transfection

Normalement je devais cotransfecter dans une lignée cellulaire un plasmide avec le promoteur qu'on étudie et qui contrôle l'Expression de la luciferase, et le plasmide controle codant pour la beta-Gal.  [...] Problème. une fois la transfection finit (seulement 5-10 minutes aprés), je m'aperçois que la personne qui a écrit les concentrations de plasmides a fait une erreur. Donc mon plasmide control est 10 fois moins concentré…du coup dans la panique (il me faut absolument réussir cette transfection) j'ai procédé a une autre transfection sur les mêmes cellules avec le plasmide contrôle pour essayer de complémenter (dans les 30 minutes après la première transfection)…je sais c'est stupide. Mais quand on panique….  [...]

[Biologie Moléculaire] Phosphorylation sur tyrosine => dégradation par protéasome???

Et est ce que ce n'est pas tout simplement un effet de compétition d'expression (ou de transfection) entre les deux plasmides Moi je commencerai par regarder ça avant de me lancer dans des explications physiologiques complexes.  [...] Alors en fait cette protéine est bien ubiquitinylé (.) par des complexes qui reconnaissent des sérines phosphorylées sur cette protéine. Pour ce qui est du MG-132 je n'ai pas encore fait le test. sinon pour ce qui est de la compétition d'expression j'ai fait un contrôle de transfection en cotransfectant le plasmide de la protéine X avec le vecteur d'expression vide de la protéine Y et de plus lorsque je cotransfecte le plasmide de ma prot X avec le plasmide de la kinase Y inactive j'ai l'effet inverse c'est à dire une accumulation d'X.  [...]

[Biologie Moléculaire] Fournisseur plasmide d'expression (avec ORF spécifique)

Je recherche une boite qui pourrait me fournir (rapidement) un plasmide d'expression avec l'ORF de mon choix (de la même manière que l'on choisi des siRNA dans une banque).  [...] La question que l'on pose à l'aide de ce plasmide est urgente donc j'aimerai trouver le plus vite possible un plasmide d'expression AVEC PROMOTEUR et l'ORF d'intérêt. J'ai regardé chez Dharmacon, Invitrogen, Qiagen, Eurogentec et je n'ai rien trouvé.  [...]

Expression brainbow après recombinaison CRE-LOX dans embryons de souris.

Si vous infectez vos neurones avec un retro ou un lenti, vous aurez même la chance d'avoir une expression théoriquement infinie, grâce à l'intégration de l'ADN apporté, contrairement à un plasmide qui resterait épisomal.  [...] de façon générale pour le système CRE. le délai de recombinaison est variable et dépend de la cible et du promoteur qui controle la CRE. De même, pour la date minimale de recombinaison dans le cas d'une CRE inductible dépend de la cinétique d'expression de son promoteur, de la dose d'inductant etc. Dans tous les cas il faudra essayer.  [...]

[Biologie Moléculaire] D'une protéine à un gène à une protéine

Ensuite, si tu as besoin de modifications post-traductionnelles (glycosylation, formation de ponts disulfure) tu peux mettre ce gène dans un plasmide d'expression eucaryotique, et faire de l'expression dans des cellules CHO, par exemple.  [...] Et ils optimisent les codons pour l'expression dans l'hôte choisi, ils optimisent les séquences pour la stabilité des mRNA, et on peut leur imposer des sites de restrictions dans le gène (pratique pour faire des cassettes)... Si on leur donne le plasmide d'expression, ils font même le clonage (mais il y a un surcoût de quelques centaines d'euros).  [...]

Question de génétique

Bonjour, je me présente. Bara'ah, 22 ans, étudiante en master 1 de maths et info du vivant, et atteinte d'une maladie génétique. l'ataxie de Friedreich.. En fait, j'aurais une question au niveau de la transcription des gènes.   [...] Si la question porte sur le fait de modifier le site de transcription naturel d'un gene, non je ne crois pas que ca soit possible. Par contre si tu parles d'un gene cloné sur un plasmide d'expression alors la je dirais que tu peux t'arranger grosso modo comme tu veux.  [...]

Transfection plasmide gateway et faible expression proteique

J'essaye en ce moment de transfecter un plasmide pDEST40 (construit avec technologie gateway) et j'obtiens une expression proteique vraiment très faible.  [...] Au delà de mes manip, j'aurais quand même voulu savoir pourquoi ce plasmide nous donnes une si faible expression protéique...par curiosité.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Sinon le sens du contrôle négatif (je ne suis pas certain que cela ait été dit clairement) est d'évaluer indirectement la qualité de la coupure du plasmide. Si après vos restrictions il vous reste du plasmide non coupé, il va transformer. Ce qui est intéressant dans ce contrôle c'est de le comparer à votre boite expérimentale.  [...] Si vous avez 10 000 colonies sur la boite expérimentales et 10 colonies sur la boite contrôle c'est bon. Vous piquez quelques colonies et vous savez que la majorité de vos clones contiendront l'insert. Si vous avec 10 000 et 8 000, vous savez que vos restrictions de plasmides ne sont pas efficaces et qu'il va vous falloir screener pas mal de colonies pour trouver vos petits. Prévoir un colony lift dans ces cas là.  [...]

[Biochimie] Plasmide de clonage et d'expression

je suis à la recherche d'un professeur de biochimie ou une personne pouvant me dire concrètement comment distinguer par l'intermédiaire d'une carte de restriction si [un plasmide est dit de clonage ou d'expression.  [...] POur ta question sur les plasmides, la seule difference entre un plasmide de clonage et un plasmide d'expression, est que le second possede un promoteur permettant l'expression du gene.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transduction/transfection

C'est une question interéssante et j'avoue que je ne suis pas sûre de moi mais je n'avais pas la même idée que toi, pour moi la différence ne réside pas dans une expression stable ou prolongée. Pour moi, la transfection c'est utiliser des méthodes chimiques ou physiques pour introduire ton plasmide, comme des liposomes, ce qui n'empêche pas de distinguer une transfection stable et transitoire.  [...] J'aurais du coup une autre question. la lipofectamine permettant juste l'entrée, il faut que le plasmide en question puisse s'intégrer dans l'ADN de la cellule si on veut une expression permanante. Je sais que la lignée que j'ai, exprimant un canal dans le plasmide pCIneo (promega), exprime de façon permanente cette molécule.  [...]